小鼠adam10基因启动子克隆和双荧光素酶报告基因系统构建及鉴定

本研究旨在克隆小鼠adam10基因启动子,构建以adam10基因启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统并分析其活性,为研究adam10基因转录调控提供有效工具。以BALB/c小鼠脑组织为模板,采用PCR方法克隆小鼠adam10基因启动子序列至pCR-Blunt载体,酶切后连接至荧光素酶报告质粒pGL4.10启动子区域,构建重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10,采用阳离子脂质体法与阳性对照质粒pGL4.74共转染真核细胞293FT,以离子霉素刺激为刺激组、DMSO为未加干预组,同时以不含启动子的pGL4.10与阳性对照质粒pGL4.74共转染组为阴性对照组,化学发光仪检测荧光强度及比例。结果表明,酶切及测序验证克隆的adam10启动子序列正确且无突变,构建的重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10与阳性对照质粒pGL4.74载体成功共转染293FT细胞,pGL4.10-adam10转染细胞后具有转录活性。离子霉素刺激组活性明显高于DMSO组,荧光比值约为DMSO组2倍(P<0.05),阴性对照组不具备转录活性。结论:成功克隆了adam10启动子并构建了重组荧光素酶报告质粒pGL4.10-adam10,离子霉素可增强adam10基因启动子转录活性。     

慢病毒载体介导的鼠基因工程调节性T细胞对小鼠移植物抗宿主病的作用研究

目的 通过慢病毒载体介导的鼠叉状头螺旋转录因子(Foxp3)基因表达构建鼠基因工程调节性T细胞(Tr),探讨输注基因工程Tr细胞对小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病(GVHD)的影响.方法 利用慢病毒载体介导,将鼠Foxp3基因转导入BALB/c小鼠的CD4+CD25-T淋巴细胞,即为基因工程Tr细胞.建立小鼠异基因骨髓移植模型,在移植时联合输注基因工程Tr,通过受鼠移植后生存期、组织病理学改变、炎性细胞因子浓度等指标评价其防治GVHD的作用.并与单纯照射组、移植对照组、空载体对照组相比较.结果 单纯照射组、移植对照组、工程Tr组和空载体对照组小鼠存活时间分别为(8.8±0.6)d、(36.7±2.5)d、(51.6±4.0)d和(34.1±2.3)d,工程Tr组小鼠存活时间明显长于其他各组(P＜0.05).移植对照组及空载体对照组小鼠肝脏、皮肤和小肠病理切片均存在GVHD病理改变,工程Tr组长期存活小鼠的肝脏、皮肤和小肠常规病理切片结构基本正常,未见GVHD病理表现.移植后移植对照组、工程Tr组、空载体对照组受鼠血清IFN-γ、IL-2和TNF-α浓度在21～28 d时达高峰,工程Tr组在21 d时IFN-γ、IL-2和TNF-α浓度高峰较其他两组为低(P＜0.05).结论 小鼠异基因骨髓移植时联合输注基因工程Tr细胞可通过减少受鼠移植后炎性细胞因子的分泌有效减少GVHD的发生,减轻其严重程度.     

竞争抑制0610009E02Rik长链非编码RNA重组腺病毒穿梭载体的构建与鉴定

目的 构建可竞争抑制肝细胞内0610009E02Rik长链非编码RNA(lncRNA)的重组腺病毒穿梭载体,为探索0610009E02Rik/Notch1在肝静脉闭塞病(HVOD)肝细胞损伤修复中的作用提供有效实验方法.方法 采用基因组DNA提取试剂盒对截取的C57BL/6小鼠尾进行基因组DNA的提取,通过PCR扩增出0610009E02Rik与Notch1基因第34个外显子重叠的1 000 bp基因序列,并连接入经BamHⅠ/Nhe Ⅰ双酶切后的腺病毒穿梭载体GV359;竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒穿梭载体与辅助包装质粒pBHG共转染HEK293细胞,并对竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒进行包装、扩增,采用氯化铯(CsCl)不连续密度梯度离心与连续密度梯度离心2个步骤对重组腺病毒进行浓缩纯化,并对重组腺病毒滴度进行测定;测定不同感染复数(MOI)竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒感染肝细胞株H2.35的感染效率,并采用实时聚合酶链反应(RT-PCR)与Western blotting对竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒感染肝细胞株H2.35与同步培养的对照肝细胞中竞争抑制0610009E02Rik lncRNA片段、Notch1 mRNA及0610009E02Rik lncRNA相对表达水平及其蛋白表达水平,并进行统计学分析.结果 ①经基因序列比对分析发现0610009E02Rik与Notch1的第34个外显子存在分子量为1 000 bp的重叠序列,依据0610009E02Rik与Notch1基因序列设计含BamH Ⅰ/Nhe Ⅰ酶切位点特异性引物,通过PCR扩增出片段长度为1 000 bp的0610009E02Rik与Notch1基因第34个外显子重叠序列的竞争抑制0610009E02Rik lncRNA片段,DNA测序结果显示竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒穿梭载体与理论预期序列构建成功.②将竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒穿梭载体转染HEK293细胞后第12天,约90％细胞出现细胞病变(CPE),收集细胞获取病毒液.浓缩纯化病毒液经梯度稀释在感染HEK293细胞后第10天,于显微镜下观察稀释梯度1∶ (10～1010)均出现CPE,病毒滴度约为5.01×109 PFU/mL.③当竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒MOI为80,感染肝细胞株H2.35 48 h后感染效率高达95％.收集经竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒感染后肝细胞,通过RT-PCR检测竞争抑制0610009E02Rik lncRNA片段相对表达水平为同步培养肝细胞株H2.35对照的3.13±0.83倍,且差异有统计学意义(P=0.047);Notch1 mRNA相对表达水平为对照细胞的(0.38±0.08)倍,且差异亦有统计学意义(P=0.010);0610009E02Rik lncRNA相对表达水平为对照细胞的(1.04±0.26)倍,但差异无统计学意义(P＞0.05).经Western blotting检测发现,重组腺病毒感染后肝细胞Notch1蛋白表达水平较对照肝细胞减低,与Notch1 mRNA相对表达水平检测结果相一致.结论 成功构建竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒穿梭载体,重组腺病毒感染肝细胞H2.35后,可下调肝细胞内Notch1 mRNA表达水平及其蛋白表达水平,这为HVOD肝细胞损伤修复的深层机制研究奠定实验数据基础.     

康惠尔敷料治疗压疮的疗效观察

目的:观察康惠尔敷料对患者压疮的治疗效果,为临床上压疮治疗提供依据。方法:将46例并发有压疮患者随机分为对照组和实验组,每组23例,实验组采用康惠尔外贴创面治疗,对照组采用传统的方法治疗,评估两组治愈率及治愈时间,观察两组压疮生长及愈合情况。结果:实验组治愈率(73.9%)显著高于对照组(34.8%),两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组治愈时间显著短于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:相较于常规治疗手段,康惠尔敷料可提高压疮患者治愈率,缩短治愈时间,值得临床推广使用。     

miR-322对大鼠高原性肺动脉高压的作用及机制研究

目的 探讨miR-322对高原肺动脉高压发生发展的影响及作用机制。方法 SPF级雄性SD大鼠40只,随 机数字表法分为4组（n=10）,即常氧组、低氧组、空白病毒+低氧组（空载体组）,miR-322抑制+低氧组（miR-322沉默 组）,剔除实验过程中死亡大鼠后常氧组 10 只,低氧组、空载体组、miR-322 沉默组各 9 只。测定肺动脉氧分压 ［p（O2 ）］和平均肺动脉压（mPAP）;HE染色观察肺组织变化;免疫荧光观察组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达变 化;实时荧光定量PCR检测大鼠肺组织中miR-322和apelin mRNA基因表达;Western blot法检测大鼠肺组织中apelin 蛋白的表达。结果 低氧组和空载体组肺动脉p（O2 ）、mPAP和肺组织各项指标差异均无统计学意义。与常氧组比 较,低氧组mPAP、α-SMA、apelin mRNA和蛋白以及miR-322 mRNA相对表达量均升高,p（O2 ）下降（P＜0.05）;肺组织 破坏严重,大量炎症细胞浸润。与低氧组比较,miR-322 沉默组 mPAP 和 miR-322 mRNA 相对表达量均下降,α- SMA、p（O2 ）以及apelin mRNA和蛋白相对表达量上升（P＜0.05）;肺组织损伤程度降低。结论 抑制miR-322表达可 促进高原肺动脉高压模型大鼠apelin的表达,进而降低高原肺动脉高压的上升程度。     

西达本胺对急性T淋巴细胞白血病CD8+T细胞的调控作用研究

目的：探讨西达本胺对急性T淋巴细胞白血病CD8+T细胞的调控作用。方法：通过荧光定量PCR检测西达本胺处理的Jurkat细胞、淋巴细胞、与西达本胺处理的Jurkat细胞共培养的淋巴细胞的CXCL9、CXCL3 m RNA表达水平。通过流式细胞术检测西达本胺处理的淋巴细胞、与西达本胺处理的Jurkat细胞共培养的淋巴细胞中CD8+T细胞的比例。结果：西达本胺上调Jurkat细胞系CXCL9的m RNA表达，上调水平呈剂量依赖（r=0.950），西达本胺5μmol/L组的CXCL9 m RNA表达是无处理组的164倍。西达本胺上调淋巴细胞CXCL9的m RNA表达，上调水平明显低于同浓度西达本胺处理的Jurkat细胞系。与西达本胺处理的Jurkat细胞共培养，可以上调淋巴细胞中CD8+T细胞的比例。结论：急性T淋巴细胞白血病中，西达本胺可能通过上调肿瘤细胞CXCL9的表达，增加肿瘤微环境中CXCL9的浓度，导致CD8+T细胞数量的增加。     

幽门螺杆菌阴性消化性溃疡临床特征及与出血关系的临床研究

消化性溃疡(PU)是一种常见的慢性消化系统疾病,主要包括十二指肠溃疡、胃溃疡或复合性溃疡等,病因复杂.大量研究已证明幽门螺杆菌(Hp)感染是引起PU的重要病因之一,但随着国内外日益重视根除Hp,Hp相关性溃疡的发病率逐步下降,而Hp阴性PU的发病率日益增加[1].Hp阴性PU是指通过呼气试验、病理等检查排除Hp感染,且经过内镜证实黏膜损伤程度超过3 mm的溃疡[2].目前发现,Hp阴性PU有较严重的溃疡病变、较长时间的抗酸治疗和较高的死亡率[1,3].PU较常见的并发症是出血,且Hp阴性PU可能更容易并发出血[4].为进一步了解Hp阴性PU的特征及其与出血的关系,本文为此作进一步探讨,现报告如下.     

新形势下南疆军队医院防范恐怖袭击的策略

当前新形势下,新疆“三股势力”空前膨胀,特别是南疆地区,“三期叠加”的态势没有根本改变,高压“严打”下暴恐事件仍然居高不下,多发、频发且有一定升级态势,政府、公安、军队等国家机关常常是暴恐分子袭击的目标.军队医院作为一个开放式单位,为一级军事医疗单位,“平时应诊、急时应急、战时应战”是其根本宗旨;一方面要担负所辖区域官兵的医疗保健和卫勤保障;另一方面,还要负责所在驻地老百姓的医疗就诊服务.因此,军队医院又不同于一般国家机关,具有更易遭受恐怖袭击的潜在性[1].如何保证军队医院本身不被恐怖分子袭击,是当前南疆军队医疗机构面临的现实而紧迫的课题.笔者在援疆期间走访调查了几所军队医院,分析了这些医院防范恐怖袭击的难点,并就应当采取的策略以及对防范恐怖袭击的具体措施提出一些建议.     

痰热清联合抗生素治疗社区获得性肺炎疗效Meta分析

 目的 系统评价痰热清联合抗生素治疗社区获得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)的疗效及安全性。方法 检索Pubmed、Embase、CBM、CNKI、VIP和万方等中英文数据库, 对国内外公开发表的关于痰热清联合抗生素治疗CAP临床疗效的随机对照试验文献, 采用Jadad质量评分法进行评价, 对纳入的文献采用Rev Man 5.2.6软件进行Meta分析。结果 共纳入32篇文献, 共3429例患者, 治疗组1747例, 对照组1682例。Meta分析结果 显示, 痰热清联合抗生素治疗CAP在总有效率、退热时间、咳嗽咳痰消失时间、肺部啰音消失时间、胸部阴影消失时间、血中白细胞恢复正常、住院时间等方面较单纯抗生素治疗优势明显, 中性粒细胞分类、C反应蛋白(CRP)指标比较无统计学差异, 提示可能不是疗效监测的有效指标。结论 现有的有限证据表明, 痰热清联合抗生素治疗CAP总有效率高于单纯抗生素治疗CAP, 且安全可靠。
     

慢病毒载体介导的shRNA对小鼠T细胞CD28基因表达的影响

目的探讨编码针对小鼠CD28的短发卡状RNA（short hairpin RNA,shRNA）的慢病毒载体对小鼠T细胞CD28基因表达的影响。方法设计并合成3对靶向小鼠CD28的特异性干扰序列和1对非特异性干扰序列,亚克隆入慢病毒载体pLB中,构建出重组慢病毒干扰质粒,行PCR鉴定并进一步测序证实。分别将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,生产慢病毒颗粒,并依据绿色荧光蛋白（GFP）表达水平检测病毒滴度。慢病毒感染小鼠脾淋巴细胞,实时荧光定量RT-PCR和Western blot技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测CD28的表达。结果PCR鉴定及测序结果证实4种重组慢病毒质粒均构建成功,重组慢病毒滴度均达1×1011U/L。感染T细胞后,CD28基因mRNA和蛋白表达量均有明显下降。结论成功构建了CD28 shRNA慢病毒载体,可有效下调小鼠T细胞CD28基因的表达,其为进一步研究体内沉默CD28基因控制移植物抗宿主病奠定了基础。