人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应因子

背景：外源性刺激引起血管屏障功能损伤的分子机制是血管病理生理学尚未阐明的热点问题之一。 目的：探讨炎症递质脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应分子,寻找有效治疗靶点。 方法：应用脂多糖刺激并观察人脐静脉内皮细胞骨架蛋白F-actin和细胞单层通透性的改变。应用荧光免疫组化和Western blot方法检测脂多糖刺激前后细胞中RhoA和SRF等信号分子的改变。并通过阻断实验证实RhoA-SRF信号通路的作用。 结果与结论：100 µg/L脂多糖刺激6 h可引起人脐静脉内皮细胞中F-actin快速重构并形成大量应力纤维,细胞单层通透性明显增强。细胞中活化RhoA的表达明显增加,SRF发生明显的入核转位现象。应用特异性分子抑制剂Y27632抑制RhoA的活化后,细胞中F-actin重构现象消失,细胞单层通透性增加也受到明显抑制,SRF蛋白发生明显的出现转位。而应用Latrunculin B抑制脂多糖刺激的人脐静脉内皮细胞中F-actin应力纤维形成,对抗通透性增加,但RhoA活化未受到干扰,SRF入核现象则受到抑制。提示RhoA-SRF通路的活化介导了脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞中F-actin重构和内皮单层通透性增加,特异性抑制F-actin也可以阻断脂多糖引起的血管内皮单层通透性增加,同时反馈抑制SRF的入核活化现象。     

信号转导分子smad4基因表达抑制体外培养人血管平滑肌细胞的增殖

目的:探讨细胞内转化生长因子β信号通路中信号转导分子Smad4与平滑肌细胞的增殖关系。方法:实验于2003-08/10在哈尔滨医科大学医学遗传学研究室完成。①取体质量200g左右的健康雄性SD大鼠,常规胶原酶消化法原代培养大鼠血管平滑肌细胞。用体积分数为0.2和0.05(去血清培养)胎牛血清和的Dulbecco改良的Eagle培养基,37℃,体积分数0.05CO2进行培养,2.5g/L胰酶消化传代。血管平滑肌细胞经锥虫蓝染色,存活细胞数在98%以上。形态学上出现典型的“峰和谷”样生长状态,抗平滑肌特异α-肌动蛋白免疫组织化学染色阳性。取3～8代细胞用于实验。②观察项目:转染前后细胞增殖能力和细胞凋亡能力的检测应用流式细胞分析仪和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法凋亡检测试剂盒完成。smad4的表达及部分与细胞周期调控相关基因(p16、细胞周期调控激酶4和细胞周期因子E)和细胞凋亡基因(半胱天冬酶2和半胱天冬酶3)表达变化应用免疫印迹法和荧光免疫组化方法检测。结果:①转染前后细胞增殖能力和细胞凋亡能力流式细胞分析仪和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法测定结果:smad4基因过表达调控人血管平滑肌细胞增殖能力下降DNA合成前期细胞明显增加[(72.33±4.35)%],正常培养细胞DNA合成前期细胞数相对较少[(45.88±1.58)%]。②smad4的表达及部分与细胞周期调控相关基因免疫印迹法和荧光免疫组化方法检测结果:转染后细胞凋亡能力增加;细胞周期抑制基因p16表达增加,细胞周期调控激酶4和细胞周期因子E表达下降,凋亡相关基因半胱天冬酶2和半胱天冬酶3表达增加。结论:smad4基因对血管平滑肌细胞增殖能力的抑制作用主要通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的发生而实现。转化生长因子β信号传导通路对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用除了能够有效阻滞细胞周期的演进外,还能够诱导细胞凋亡。     

CREG1蛋白对血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心功能损伤的影响

目的探讨E1A激活基因阻遏子(CREG1)蛋白能否改善心肌纤维化小鼠的心功能。方法应用基因打靶方法建立广泛性基因敲除的CREG1杂合子小鼠和CREG1野生型小鼠模型。应用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)皮下埋泵方法建立小鼠心肌纤维化损伤模型,给予AngⅡ刺激14d后,采用HE和Masson染色检测小鼠心肌纤维化情况。应用Western blotting和免疫组化染色技术检测给予AngⅡ前及3、7、14d后两组小鼠心肌中CREG1蛋白的表达,并于给予AngⅡ14d后应用小动物超声仪检测心功能情况。AngⅡ给药同时,以皮下埋泵方式分别给予15、30、60、300μg/(kg·d)的外源性重组CREG1蛋白(治疗组)和生理盐水(对照组)14d,检测心功能,并应用TUNEL染色和Western blotting检测心肌凋亡情况。结果 Western blotting和免疫组化检测结果显示,未给予AngⅡ刺激时杂合子小鼠心肌中CREG1蛋白表达明显低于野生型小鼠(P<0.05)。给予AngⅡ刺激3、7、14d时,野生型小鼠和杂合子小鼠心肌中CREG1蛋白表达均明显下降(P<0.05),但杂合子小鼠下降更为显著(P<0.01);HE和Masson染色显示杂合子小鼠心肌纤维化程度较野生型小鼠严重,二者心功能明显下降,且杂合子小鼠心功能下降更为明显(P<0.05)。给予外源性重组CREG1蛋白治疗后,治疗组心功能较对照组明显改善(P<0.05),心肌凋亡数量明显下降(P<0.05)。结论在AngⅡ引起的小鼠心肌纤维化模型中,CREG1蛋白减少可使小鼠心功能损伤加重,给予外源性重组CREG1蛋白可明显改善心功能。     

PON1基因rs854572单核苷酸多态性与氯吡格雷抵抗的相关性研究

目的 探讨对氧磷酶1(PON1)基因rs854572单核苷酸多态性与氯吡格雷抵抗(CR)发生的相关性.方法 采用病例-对照研究的方法,共人选850例沈阳军区总医院冠心病住院患者,采用光学比浊法测定20μmol/L二磷酸腺苷(ADP)诱导的残余血小板聚集率(RPA),当RPA≥70％时,即定义为CR.将入选患者分为CR组(n=215)和非氯吡格雷抵抗(NCR)组(n=635),采用焦磷酸测序法测定PON1基因rs854572单核苷酸多态性的基因型及等位基因分布频率.结果 PON1基因rs854572多态位点在两组间基凶型分布频率皆符合Hardy-Weinberg平衡定律,三种基凶型(CC、CG和GG)分布频率在CR组和NCR组分别为23.7％、49.3％、27.0％和24.1％、50.2％、25.7％,三种基因型在两组间分布频率差异无统计学意义(P=0.93).C、G等位基因分布频率在两组间差异亦无统计学意义(P=0.763).Logistic回归校正性别、年龄、体重指数、吸烟、高血压、高脂血症及糖尿病等冠心病易患因素后,PON1基因rs854572单核苷酸多态性仍与冠心病患者CR的发生无相关关系.结论 PON1基因单核苷酸多态位点rs854572与冠心病患者CR的发生无关.     

p53介导的凋亡相关基因的研究进展

p53是重要的细胞周期调控基因之一。在参与维持细胞周期的正常运行中起着重要作用，p53基因通过诱导细胞发生G1期阻滞修复损伤DNA和诱导细胞凋亡来抑制肿瘤细胞的增殖。在p53基因介导细胞凋亡的通路中，有许多已知和未知的相关基因发生作用。本就p53基因调控细胞凋亡途径的上，下游已知基因作一综述。     

非小细胞肺癌6号染色体长臂的基因扫描分析

目的 探讨6号染色体长臂上与非小细胞肺癌发生相关的微卫星位点。方法 应用多重PCR对41例非小细胞肺癌中6号染色体长臂上的18个微卫星位点进行扩增。PCR产物应用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳结果用Gene Scam^TM,Genotyper^TM软件进行分析，结果 各个位点有明显的不同的杂合性缺失（loss of heterozygosity,LOH）频率，从3.85%到38.45%不等，总LOH频率为58.5%(24/41)。LOH频率超过20％的位点共有8个，主要分布的6q24及6q27。具体范围为6q24-6q25.3[D6S1699(35%)、D6S409(23.33%)、D6S441(33.33%)]及6q26-27[D6S1550(38.45%)、D6S264(20%)、D6S1585(25%)、D6S446(33.33%)、D6S281(30.77%]。结论 6q24及6q27附近可能存在与非小细胞肺癌发生相关的肿瘤抑制基因。     

2 型糖尿病小鼠不同时间点的病理生理变化

目的 检测不同时间点2 型糖尿病（T2DM）小鼠模型代谢指标、血清胰岛素、心功能等指标,明确T2DM 小鼠模型发生病理改变的时间。方法 雄性8 周C57BL/6 小鼠采用高脂联合链脲佐菌素（STZ）方法复制T2DM 动物模型,在STZ 注射不同时间点,罗氏血糖仪测量小鼠空腹血糖。用Elisa 试剂盒检测小鼠血清胰岛素,应用小动物超声检测小鼠左心室功能。苏木素- 伊红染色及Masson 染色观察心脏大小形态及心肌纤维化情况。结果 STZ 注射1 周后实验组小鼠空腹血糖升高,2 周后出现糖耐量和胰岛素耐量异常;8 周时,清胰岛素异常及左心室舒张功能障碍,并出现左心室肥厚和纤维化;12 周时出现左心室扩张,纤维化加重。结论 STZ 注射2 周小鼠空腹血糖升高,8 周时血清胰岛素降低,并发生左心室肥厚及舒张功能下降,12 周时左心室收缩功能下降,为研究T2DM 的发病机制及干预治疗提供了实验依据。     

动脉内皮细胞中TIE2启动CREG真核表达质粒pTIE2-CREG-EGFP-N1的表达

背景：血管内皮发生的分子机制是细胞及基因替代治疗的首要前提。 目的：构建一种通过血管内皮细胞特异蛋白TIE2启动子来启动表达的E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG)和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)融合的真核表达质粒。 方法：根据GenBank中公布的TIE2基因的启动子序列,人工合成TIE2启动子DNA序列,经AseⅠ和NheⅠ双酶切后,亚克隆入表达质粒pEGFP-N1中构建pTIE2-EGFP-N1。同时,用BamHⅠ和EcoRⅠ 双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入质粒pTIE2-EGFP-N1中构建pTIE2-CREG-EGFP-N1,酶切鉴定。应用脂质体法将该质粒转染至体外培养的小鼠动脉内皮细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。 结果与结论：经酶切鉴定证实实验构建的pTIE2-CREG-EGFP-N1质粒正确;体外转染48 h,荧光显微镜下可见EGFP的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。说明实验成功构建了pTIE2-CREG-EGFP-N1重组质粒,其可携带目的基因在小鼠动脉内皮细胞中有效表达。     

雌激素洗脱支架的动物实验研究

为观察雌二醇洗脱支架植入对高脂喂养兔腹主动脉内膜增生的影响,并探讨其可能的机制,将雄兔高脂喂养后分别于腹主动脉植入裸金属支架、磷酸胆碱（PC）涂层支架和17 β-雌二醇洗脱支架（E2洗脱支架）,应用HE染色、免疫组化染色及蛋白印迹方法观察17 β—E2洗脱支架抑制内膜增生的作用及机制。结果表明各组支架植入12周时血管内膜均明显增厚,E2洗脱支架组新生内膜面积较裸金属支架组减少36％;支架植入术后血管壁ERK迅速活化,磷酸化-ERK（P—ERK）在术后0．5h时达峰值,24h后降至基础水平;支架植入后0．5h时E2洗脱支架组P—ERK表达则明显低于裸金属支架组。2周时E2洗脱支架组内皮化率明显高于裸金属支架组及PC涂层支架组。结论：E2洗脱支架安全、有效,可明显减少实验兔支架植入后的血管内膜增生;与普通裸金属支架相比,E2洗脱支架能够加速支架段血管的再内皮化;丝裂原激活蛋白激酶ERK1／2介导了支架植入后VSMC的增殖和内膜增生,E2可以部分阻断该信号转导通路ERK1／2的活化。