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21.
背景:血管内皮发生的分子机制是细胞及基因替代治疗的首要前提。
目的:构建一种通过血管内皮细胞特异蛋白TIE2启动子来启动表达的E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG)和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)融合的真核表达质粒。
方法:根据GenBank中公布的TIE2基因的启动子序列,人工合成TIE2启动子DNA序列,经AseⅠ和NheⅠ双酶切后,亚克隆入表达质粒pEGFP-N1中构建pTIE2-EGFP-N1。同时,用BamHⅠ和EcoRⅠ 双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入质粒pTIE2-EGFP-N1中构建pTIE2-CREG-EGFP-N1,酶切鉴定。应用脂质体法将该质粒转染至体外培养的小鼠动脉内皮细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。
结果与结论:经酶切鉴定证实实验构建的pTIE2-CREG-EGFP-N1质粒正确;体外转染48 h,荧光显微镜下可见EGFP的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。说明实验成功构建了pTIE2-CREG-EGFP-N1重组质粒,其可携带目的基因在小鼠动脉内皮细胞中有效表达。 相似文献
22.
背景:外源性刺激引起血管屏障功能损伤的分子机制是血管病理生理学尚未阐明的热点问题之一。
目的:探讨炎症递质脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应分子,寻找有效治疗靶点。
方法:应用脂多糖刺激并观察人脐静脉内皮细胞骨架蛋白F-actin和细胞单层通透性的改变。应用荧光免疫组化和Western blot方法检测脂多糖刺激前后细胞中RhoA和SRF等信号分子的改变。并通过阻断实验证实RhoA-SRF信号通路的作用。
结果与结论:100 µg/L脂多糖刺激6 h可引起人脐静脉内皮细胞中F-actin快速重构并形成大量应力纤维,细胞单层通透性明显增强。细胞中活化RhoA的表达明显增加,SRF发生明显的入核转位现象。应用特异性分子抑制剂Y27632抑制RhoA的活化后,细胞中F-actin重构现象消失,细胞单层通透性增加也受到明显抑制,SRF蛋白发生明显的出现转位。而应用Latrunculin B抑制脂多糖刺激的人脐静脉内皮细胞中F-actin应力纤维形成,对抗通透性增加,但RhoA活化未受到干扰,SRF入核现象则受到抑制。提示RhoA-SRF通路的活化介导了脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞中F-actin重构和内皮单层通透性增加,特异性抑制F-actin也可以阻断脂多糖引起的血管内皮单层通透性增加,同时反馈抑制SRF的入核活化现象。 相似文献
23.
背景:骨髓间充质干细胞移植后极低的生存率限制了它的治疗作用,现正在寻找合适的药物促进其增殖。
目的:观察独参汤是否能促进骨髓间充质干细胞的增殖,并筛选出最佳干预浓度。
方法:分离培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞。培养、传代至第5代,利用流式细胞仪检测表面分子标记物。以每孔1×104数量种于96孔板。将独参汤颗粒剂分别以10,5,2.5,1.25,…0.019 5 g/L的质量浓度干预骨髓间充质干细胞,于第1,7天MTT法检测其增殖情况。
结果与结论:①原代细胞接种2 d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列。②第5代骨髓间充质干细胞CD44阳性细胞占94.7%,CD90阳性细胞占86.8%,CD34阴性细胞占98.7%,CD45阴性细胞占97.1%。③独参汤浓度在0.625,0.312 5,0.156,0.078,0.039,0.019 5 g/L质量浓度时均可以促进骨髓间充质干细胞在体外的增殖。其中在质量浓度为0.078 g/L时作用最强。 相似文献
24.
高低转移肺腺癌细胞系中肿瘤抑制基因p16、p21和p53表达研究 总被引:6,自引:0,他引:6
目的 探讨肿瘤抑制基因对肺腺癌细胞生长的抑制作用。方法 利用FuGene转染方式分别将p21和p16基因的表达质粒转入-对肺腺癌细胞系Anip973和AGZY83-a中,同时用含野生型p53 基因的腺病毒感染p16基因转染前后的这一对细胞系。对P16和P21蛋白过表达的细胞系进行了细胞生长曲线、克隆形成率、原位末端标记分析和流式细胞仪分析。结果 p16基因的过表达只能使细胞系的G1期细胞比例提高,但细胞生长曲线,克隆形成率均未出现改变,未检测到凋亡信号。P21蛋白过表达的一对细胞系细胞生长曲线斜率降低,克隆形成能力下降,并出现明显的G1期阻滞,但未检测到凋亡信号。p53基因感染AGZY83-a,Anip973及经过p16基因转染的细胞AGZY83-ap16和Anip973p16后呈现时间依赖性表达,细胞生长曲线和四唑盐比色法分析提高,野生型p53基因的大量表达明显抑制以上4种细胞的生长,Anip973和Anip973p16的生长抑制率高于AGZY83-a和AGZY83-ap16;Anip973p16和AGZY83-ap16的生长抑制率高于Anip973和AAGZY83-a。这4种细胞在感染p53后出现典型的凋亡信号。结论p16基因的过表达并不能抑制细胞系的生长,而p21基因的过表达通过G1期阻滞抑制这1对肺腺癌细胞的生长;野生型p53基因在AGZY83-a和Anip973中高效表达可产生明显的细胞生长抑制效应;野生型p53基因对肺腺癌高转移细胞系Anip973抑制作用更为明显。 相似文献
25.
26.
目的探讨在中国北方汉族人群中花生四烯酸5-脂氧合酶激活蛋白(ALOX5AP)基因单核苷酸多态性T(8733)C与心肌梗死的关系。方法采用PCR-重测序法对随机选取的无亲缘关系的48例中国北方汉族个体进行ALOX5AP基因单核苷酸多态性筛查,对经冠状动脉造影证实的125例心肌梗死患者和158例正常对照者,采用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测ALOX5AP基因T(8733)C多态性基因型和等位基因分布情况。结果通过筛查发现7个多态。心肌梗死患者ALOX5AP基因T(8733)C3种基因型(TT型、TC型和CC型)及C等位基因分布频率分别为35.2%、48.8%、16.0%和40.4%,正常对照者分别为32.9%、50.0%、17.1%和42.1%,其差异均无统计学意义(P>0.05);按性别分层进行亚组分析,心肌梗死患者与正常对照者ALOX5AP T(8733)C多态的基因型和等位基因频率差异亦均无统计学意义。结论ALOX5AP基因T(8733)C多态性与中国北方汉族人群心肌梗死的发生可能无关。 相似文献
28.
29.
目的对人类腺病毒5型早期区域1A(adenovirus type 5 early region 1A,E1A)激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A-stimulated genes,hCREG)启动子进行生物信息学分析、预测hCREG启动子位置和转录因子结合位点。方法对2005年1月至7月沈阳军区总医院全军心血管病研究所进行的从Genbank中获得hCREG的全长编码基因,利用First EF程序分析软件分析并获得hCREG的启动子序列,利用Motif软件对启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。免疫荧光染色和Western blot分别观察相关转录因子的蛋白表达与细胞内hCREG蛋白及细胞表型转化之间的关系。结果用First EF软件测定长度为945bp的hCREG启动子序列,hCREG的启动子区可能定位于转录起始点上游-109~-359bp。用Motif软件预测启动子区域共含有80多个转录调控因子结合位点,其中肿瘤抑制基因wtp53结合位点为-456bp。进一步应用蛋白质印迹(western blot)和免疫荧光染色分析wtp53与细胞表型转化的关系。在0.5%胎牛血清(fetalbovine serum,FBS)培养的HITASY细胞wtp53表达较10?S培养HITASY细胞明显增加。同时,hCREG蛋白和平滑肌细胞分化标志蛋白SMα-ac-tin亦表达增多。结论获得了hCREG启动子的转录调控信息,推测出wtp53是hCREG基因转录的重要调控因子,它可能结合于hCREG启动子区,参与hCREG蛋白对VSMCs表型转化的调控。 相似文献
30.
目的 探讨ApoM基因启动子区T-788C多态性与急性冠脉综合征(ACS)的关系.方法 采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性技术结合琼脂糖凝胶电泳和基因测序等对675例ACS患者(ACS组)和636例正常健康体检者(对照组)的ApoM基因启动子区T-788C基因型和等位基因频率进行检测.结果 ApoM基因启动子区T-788C多态性在ACS组和对照组的分布频率符合Hardy-Weinberg平衡定律.ApoM基因启动子区T-778C C等位基因及CC基因型ACS组显著高于对照组(P均<0.01).Logistic回归分析显示,在校正冠状动脉疾病易感因素后,ApoM基因启动子区T-788C C等位基因是ACS发病的独立危险因素(OR =2.14,95% CI为1.08 ~2.86,P<0.01).结论 ApoM基因启动子区T-778C多态性与ACS发病存在相关性,其中C等位基因是其独立危险因素. 相似文献