基质金属蛋白酶1基因-519A/G多态性与冠心病发病的关系

目的 研究中国北方汉族人群中基质金属蛋白酶1(MMP1)基因-519A/G单核苷酸多态性与冠心病发病的关系.方法 采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性技术结合琼脂糖凝胶电泳和基因测序等方法,检测经冠状动脉造影证实的517例冠心病患者和380例健康对照者MMP1-基因-519A/G多态性位点的基因型和等位基因分布,分析两组人群MMP1基因型和等位基因型频率的差异.结果 中国北方汉族人群中存在MMP1基因-519A/G单核苷酸多态性.MMP1基因-519A/G单核苷酸多态的AA基因型在冠心病组和对照组间的分布差异有统计学意义[67.70%(350/517)比40.26%(153/380),OR=1.64,P＜0.001,95%CI:1.44～1.86],A等位基因携带者冠心病发病的相对危险度为1.49(P＜0.001,95%CI:1.33～1.69).亚组分析显示,AA基因型在急性冠状动脉综合征(ACS)组和稳定性心绞痛组间的分布差异有统计学意义[68.81%(278/404)比51.76%(44/85),P＜0.01,95%CI:1.04～1.27].A等位基因携带者发生ACS的相对危险度为1.11(P＜0.05,95%CI:1.01～1.21).不稳定性心绞痛组与急性心肌梗死组比较,AA基因型和A等位基因的分布差异无统计学意义.结论 中国北方汉族人群中存在MMP1基因-519A/G单核苷酸多态性.MMP1基因-519A/G单核苷酸多态性与冠心病的发病相关,A等位基因携带者发生ACS的危险性增加.     

RhoA介导凝血酶或脂多糖诱导内皮细胞株单层通透性增高

目的探讨RhoA在凝血酶或脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)单层通透性改变中的作用。方法用免疫荧光和改良的Boydon小室分别检测HUVECs F-肌动蛋白和单层通透性;用Western blot和免疫组化分析HUVECs内RhoA的表达;用RT-PCR检测RhoA mRNA表达。结果HUVECs经凝血酶或LPS处理后,F-肌动蛋白解聚,细胞周边形成应力纤维,HUVECs单层通透性增高;RhoA蛋白和mRNA表达上调;Rho激酶抑制剂Y-27632能明显缓解上述变化。结论RhoA参与凝血酶或LPS诱导的HUVECs的F-肌动蛋白的重构和单层通透性的改变。     

达格列净改善2型糖尿病小鼠心肌损伤互作分子网络研究

目的 探寻达格列净改善糖尿病心肌损伤的调控分子,阐明其治疗新靶点。方法 选取20只6～8周龄的C57BL6J雄性小鼠给予高脂饮食(HFD,甘油三酯60%)喂养造模。将成模小鼠随机分成两组,达格列净干预组给予达格列净10 mg/(kg·d),HFD单独喂养组给予正常饮用水。取两组小鼠的心脏组织进行RNA提取和转录组芯片(Agilent Mouse ceRNA Microarray 2019)分析。获得两组小鼠差异表达的mRNA。进一步通过生物信息学分析明确差异表达显著的信号转导通路及相关调控基因。结果 将提取的各心肌组织RNA应用样本变异性检测确认了两组小鼠心脏组织标本的有效性。转录组学分析显示,与HFD单独喂养组比较,达格列净干预组小鼠心肌组织中共获得71个差异表达显著基因,其中,上调表达23个,下调表达48个。进一步应用GO和KEGG生物信息学软件分析证实,达格列净干预组小鼠炎性相关基因显著降低,而Toll样受体相关的信号转导通路基因活化上调。结论 达格列净改善糖尿病心肌损伤是通过抑制炎症分子和上调Toll样受体相关的信号转导通路实现的。     

饮食钾缓解盐诱导的冠状动脉损伤*

 目的：探讨饮食钾对盐诱导的冠状动脉损伤的保护机制。方法: 将4周龄SD大鼠随机分为3组,每组10只,分别是对照组（NS,蒸馏水）、高盐组（HS,含1.5% NaCl蒸馏水）和高盐补钾组（HS+HP,含1.5% NaCl和0.5% KCl蒸馏水）干预16周。每2周监测各组大鼠尾动脉血压。干预16周后,硝酸还原酶法检测大鼠血清中NO的含量;硫代巴比妥酸法检测各组大鼠血清中丙二醛（MDA）的含量; HE染色观察各组大鼠左冠状动脉的大体形态;免疫荧光染色观察各组大鼠冠状动脉内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表达;二氢乙啶荧光探针染色/Western blotting法观察各组大鼠冠状动脉氧化应激的程度。结果：高盐干预16周后,高盐组大鼠根据尾动脉血压的变化分为盐敏感性大鼠和盐抵抗性大鼠。本实验只研究HS组中盐敏感性大鼠。在HS组中,大鼠血压较NS组显著升高,给予补钾后可以缓解血压的升高。HS组较NS组大鼠血清中NO降低,MDA升高,冠状动脉eNOS表达降低,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶的gp91亚基表达升高,冠状动脉管壁厚度显著增加,且 DHE荧光探针染色发现其超氧阴离子增加。高盐摄入的同时给予补钾可以缓解高盐摄入引起的有害效应。结论：高盐摄入通过氧化应激引起冠状动脉结构和功能的改变,补钾可以缓解这一效应的发生。     

大鼠平滑肌细胞增殖与西洛他唑抑制作用的体内实验

目的:以球囊损伤SD大鼠模型颈动脉内膜增生为基础,比较西洛他唑给药组和生理盐水对照组大鼠血管内膜增生强度和平滑肌细胞增殖能力方面的差异。方法:①实验于2004-01/12在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成。实验选用健康雄性SD大鼠,体质量300～500g。②建立动物模型:腹腔麻醉36只大鼠后,暴露左颈总动脉及颈内、外动脉,自颈外动脉向近心端插入2FFogarty球囊导管至颈总动脉起始部,球囊充水0.10～0.15mL,慢速回拉至颈内外动脉分叉处,反复3次,完成后结扎颈外动脉。③36只SD大鼠随机分为2组,每组18只,分别为生理盐水组,西洛他唑给药组(7.5×10-7mol/L)。给药方式:灌肠给药,5mL/次,术后即刻开始,持续给药28d。④观察并比较两组大鼠损伤血管壁各成分结构变化图像定量分析结果。应用免疫组化分析大鼠动脉血管壁增殖情况,并应用反转录聚合酶链式反应分析两组损伤的动脉半胱天冬酶3在mRNA水平表达变化。结果:大鼠36只均进入结果分析。①大鼠动脉血管壁增殖情况免疫组化分析结果:西洛他唑给药组Ki67免疫组化染色阴性,细胞增殖能力下降;生理盐水组Ki67免疫组化染色阳性,细胞增殖能力旺盛。②损伤血管壁各成分结构变化图像定量分析结果:西洛他唑给药组大鼠颈动脉血管壁损伤后28d内膜增生面积明显小于生理盐水组犤(0.015±0.002),(0.197±0.004)mm2,t=299.06,P<0.01犦;管腔面积明显大于生理盐水组犤(0.193±0.008),(0.011±0.008)mm2,t=118.21,P<0.01犦。两组大鼠损伤动脉中膜增生面积差异不明显(P>0.05)。③两组损伤的动脉半胱天冬酶3在mRNA水平表达反转录聚合酶链式反应分析结果:西洛他唑给药组平滑肌细胞中半胱天冬酶3表达明显高于生理盐水对照组。结论:①通过在体大鼠颈动脉内膜增生模型建立,有效地模拟了西洛他唑抑制体内血管平滑肌细胞增殖的发生过程。②西洛他唑能够有效抑制体内血管平滑肌细胞增殖并诱导其凋亡,抑制血管损伤后新生内膜的形成,为临床防治增生性血管疾病的提供理论依据。     

miR-33 a调控ABCA1表达介导棕榈酸诱导肝细胞脂质代谢损伤研究

目的探讨miR-33a及其下游靶基因ABCA1在肝细胞脂质代谢中的作用。方法刺激棕榈酸(PA)制备肝细胞脂质损伤的细胞学模型。应用油红染色检测细胞内脂质堆积情况。采用实时聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白质印迹法检测miR-33a、ABCA1等表达。结果 PA刺激显著增加肝细胞中脂质成分堆积,同时miR-33a表达增加,而ABCA1表达减少。干预miR-33a表达可以介导PA诱导的脂质损伤,同时调控ABCA1表达。抑制或者增加ABCA1表达可以调控PA诱导的肝细胞代谢损伤。结论 MiR-33a与ABCA1介导PA诱导肝细胞脂质代谢损伤。     

平滑肌细胞纯化载体构建及在小鼠胚胎干细胞中的表达

背景：胚胎干细胞是平滑肌细胞重要的来源之一,但是胚胎干细胞分化细胞的异质性导致难以获得较纯的平滑肌细胞。 目的：为进一步纯化胚胎干细胞来源的平滑肌细胞,拟在体外构建平滑肌特异性SM22α启动子驱动的嘌呤霉素抗性(puromycin acetyltransferase,pac)基因与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因双表达载体,即pSM22-PAC-IRES2-EGFP载体,并在胚胎干细胞中检测其有效性及特异性。 设计、时间及地点：基因水平细胞观察实验,于2007-05/2008-09在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成。 材料：小鼠胚胎干细胞系R1购自美国ATCC公司,编号SCRC-1011TM。pSM22α-EGFP载体由本实验室构建;pIRES2-EGFP载体、pSM2C载体、pSuper.basic载体购自Invitrogen公司。 方法：用聚合酶链反应方法从pSM22α-EGFP中扩增SM22α启动子,然后用该启动子替换pIRES2-EGFP载体中的CMV启动子,构建pSM22-IRES2-EGFP。再从pSM2C中用HindⅢ/ClaⅠ酶切获得pac基因,将pac基因片段亚克隆到pSuper.basic中,构建pSuper-PAC。最后BgⅢ/AccⅠ双酶切pSuper-PAC获得pac基因片段,将其插入到pSM22α-IRES2-EGFP,构建成pSM22α-PAC-IRES2-EGFP。将pSM22α-PAC-IRES2-EGFP用脂质体法转染胚胎干细胞,G418筛选阳性克隆。诱导胚胎干细胞阳性克隆分化,RT-PCR扩增pac基因鉴定阳性克隆。对分化细胞行平滑肌细胞标志物SM α-actin免疫荧光染色。 主要观察指标：①pSM22α-PAC-IRES2-EGFP测序结果。②pac基因扩增。③荧光显微镜下同时观察分化细胞EGFP的表达及SM α-actin染色情况。 结果：HindⅢ/ClaⅠ双酶切得到261 bp,664 bp,5 000 bp 3个片段,与预期结果一致,测序结果证实pSM22α- PAC-IRES2-EGFP构建成功。Pac基因扩增证实有4株胚胎干细胞克隆转染成功。转染成功的胚胎干细胞被诱导分化后,部分细胞表达EGFP,且这些细胞SM α-actin染色呈阳性。 结论：实验成功构建了平滑肌细胞筛选载体pSM22α-PAC-IRES2-EGFP。成功转染这一载体的胚胎干细胞表达pac基因及EGFP基因,且EGFP表达具有平滑肌特异性。     

CREG基因沉默诱导小鼠ESCs来源的EBs自发性凋亡

目的: 探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)基因沉默诱导鼠源性胚胎干细胞(ESCs)来源的胚胎小体(EBs)自发性凋亡的作用。方法: 应用pDS-shRNA-CREG逆转录病毒真核表达载体和绿色荧光蛋白(GFP)的对照载体,感染鼠源性胚胎干细胞R1,筛选获得稳定的细胞克隆(R1-shCREG和R1-GFP);用小鼠胚胎成纤维细胞株STO作为饲养细胞,进行R1、R1-shCREG和R1-GFP细胞培养。倒置显微镜观察3种ESCs的生长情况。碱性磷酸酶(AKP)染色和小鼠心肌接种畸胎瘤形成实验检测转染后ESCs分化情况。当ESCs生长至亚融合状态时进行传代,去除白血病抑制因子(LIF)并悬浮培养制备EBs。用RT-PCR技术和Western blotting方法分别检测3组EBs培养7 d时CREG和cleaved caspase-3蛋白和mRNA的表达, Annexin V/PI流式细胞术检测EBs细胞凋亡情况。结果: 经pDS-shRNA-CREG逆转录病毒真核表达载体及 GFP的质粒载体转染获得稳定转染的细胞克隆。AKP染色证实R1、R1-GFP和R1-shCREG 3组ESCs均保持未分化状态。同时,体内和体外分化研究证实,R1和R1-GFP组细胞具有三胚层分化能力,小鼠心肌内注射的ESCs形成畸胎瘤组织;而R1-shCREG则不能够形成畸胎瘤类似物,细胞分化能力降低,且细胞死亡现象增加。培养7 d的R1-shCREG/EB组 CREG蛋白表达量较R1/EB组和R1-GFP/EB组均降低; CREG的mRNA表达下降;而cleaved caspase-3 mRNA和蛋白表达均显著升高;同时, R1-shCREG/EB细胞凋亡率明显升高。结论: 下调CREG表达可抑制ESCs分化,促进ESCs来源的EBs细胞凋亡的发生。