改良大鼠毛囊干细胞体外培养鉴定及诱导分化的研究

目的 探讨改良体外分离、培养、扩增、纯化SD大鼠毛囊干细胞(rHFSCs)及其免疫、超微结构的鉴定方法,观察rHFSCs的生物学特性及成脂、成骨分化能力。方法 2015年1—6月选取清洁级1周龄SD大鼠6只,在无菌条件下切取SD大鼠触须部皮肤,用 Dispase酶和Ⅳ型胶原酶混合液消化,显微镜下分离毛囊隆突部,用梯度加液组织块贴壁法培养rHFSCs,用两步酶消化法传代,用Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化rHFSCs。收集第3代rHFSCs,采用流式细胞术、免疫荧光染色及透射电镜观察rHFSCs内部结构等方法鉴定rHFSCs。收集第1～10代rHFSCs检测细胞活力,第3、5、7、9代rHFSCs培养第1～8天时检测细胞增殖能力。收集第3代rHFSCs,按培养液的不同分为诱导组和对照组,对比两组目的基因PPAR-γ、C/EBPa、OPG、Runx2的相对表达量及染色后的光密度(OD)值变化情况,观察rHFSCs的成脂、成骨分化能力。结果 通过改良方法分离、培养、纯化的rHFSCs呈典型的铺路石状,生长曲线呈“S”形,生长增殖能力良好,克隆形成能力强。透射电镜显示细胞处于原始状态。流式细胞术检测显示Integrin β1、Integrin α6、P63呈高表达,CK15呈中等表达,符合rHFSCs标记鉴定特点。免疫荧光染色和透射电镜观察rHFSCs内部结构证明细胞的类型属于毛囊干细胞。rHFSCs成脂诱导培养7 d后RFqPCR定量结果显示,诱导组目的基因PPAR-γ、C/EBPa的相对表达量(5.598±0.168、4.757±0.416)均明显高于对照组(1.119±0.344、1.126±0.355),差异均有统计学意义(t=34.955、20.266,P值均＜0.01);诱导14 d后细胞油红O染色阳性,诱导组OD值(2.472±0.091)明显高于对照组(0.817±0.003),差异有统计学意义(t=114.641, P＜0.05)。rHFSCs成骨诱导培养14天后RFqPCR定量结果显示,诱导组目的基因OPG和Runx2的相对表达量(1.921±0.275,3.892±0.265)明显高于对照组(1.085±0.288,1.046±0.216),差异均有统计学意义(t=4.667、17.332, P值均＜0.01);诱导21 d后细胞茜素红染色阳性,诱导组OD值(0.716±0.016)明显高于对照组(0.076±0.002),差异有统计学意义(t=14.078, P＜0.01)。结论 采用改良体外分离、培养、扩增、纯化方法可成功建立rHFSCs体外培养体系,rHFSCs具有纯度大、增殖效率高、多向分化潜能强等特点,可为干细胞组织工程学相关发展提供良好的种子细胞。     

3D打印技术制备新型HA/ZrO2梯度复合材料在犬股骨干骨缺损修复中的应用

目的 运用3D打印技术制备新型羟基磷灰石/二氧化锆(HA/ZrO₂)梯度复合材料,分析其性能,并观察其修复比格犬股骨干骨缺损的能力。方法 随机抽取6月龄雄性比格犬1只,截去右下肢股骨中段全层15 mm制成骨缺损模型后,放入动物专用Micro CT进行容积扫描,完成数据采集、转化及后期处理,将处理后的数据导入CeraFab 7500光固化3D打印机中。根据设定参数启动打印程序,形成复合光敏树脂初胚,并对其进一步脱脂烧结,然后采用浸涂法制备HA/ZrO₂梯度复合材料。运用扫描电镜、X射线衍射(XRD)和生物力学实验分析HA/ZrO₂梯度复合材料的性能。制备HA/ZrO₂梯度复合材料浸提液。培养小鼠成纤维细胞株L929,采用噻唑蓝(MTT)法检测HA/ZrO₂梯度复合材料对体外细胞增殖和毒性的影响。将16只比格犬随机分为4组,每组4只。A组:截取犬股骨中段15 mm后,不植入任何材料;B组、C组、D组分别截去股骨中段15、25、35 mm制成骨缺损模型,然后分别植入相应规格的HA/ZrO₂梯度复合材料。术后第2、4、8、12 周拍摄术肢股骨正侧位X片,观察植入材料与自身骨结合情况及周围骨痂生长情况。术后12 周处死实验动物,截取整段股骨,大体观察标本植入材料与周围骨生长状况;行Micro CT扫描,测定新生骨量,并对新生骨进行3D图像重建;对股骨标本进行极限抗压实验,测量极限抗压强度。结果 运用3D打印技术制备的HA/ZrO₂梯度复合材料扫描电镜显示表面光滑,结构均匀,断口表面层均匀过渡结合,没有明显界限,相互之间冶金结合,结构稳定。XRD分析显示HA及ZrO₂峰形明显、结晶程度较好、粉体纯度高。抗压试验显示极限抗压强度为(43.37±2.31) MPa。MTT试验显示HA/ZrO₂梯度复合材料无明显细胞毒性。实验动物术后X线片显示:A组术后形成骨不连;B组有连续性骨痂通过,人工假体与宿主骨之间的界线消失;C组术后第2、4、8周连续性骨痂及新生骨长入速度较B组缓慢,但人工假体与断端间隙逐渐被新生骨填充,有连续性骨痂通过;D组新骨生成缓慢,仅在断端周围出现新生骨。术后12周取材,Micro CT 3D重建及新生骨量检测,B、C、D组单位体积新生骨量分别为(238.55±19.11) mm³/cm³、(223.31±13.41) mm³/cm³、(110.83±6.48) mm³/cm³,3组间比较差异有统计学意义(F=156.824,P＜0.01),其中B、C组新生骨量明显多于D组,差异均有统计学意义(P值均＜0.05)。新生骨CT 3D重建显示:B组复合材料整体被新生骨包绕,无外露;C组复合材料少许外露,表面基本被新生骨填塞;D组复合材料大部外露,新生骨散在长入。B、C、D组股骨标本极限抗压强度分别为(49.72±2.33) MPa、(49.81±2.43) MPa、(46.92±3.61) MPa,3组间比较差异无统计学意义(F=1.119,P＞0.05)。结论 运用3D打印技术制备的纳米HA/ZrO₂梯度复合材料具有可靠的生物相容性及生物力学强度,可以实现临床个体化治疗原则,能很好地修复犬股骨干35 mm内骨缺损,是一种理想的骨组织替换材料。