环孢素A对阿霉素细胞毒性的体外增效作用

探讨了环孢素Ａ对阿霉素作用于人体胃低分化粘液腺癌细胞系的增效作用并与戊脉安的增效作用进行了比较。发现：（１）低浓度ＣｓＡ能增强ＡＤＭ对ＭＧＣ细胞系毒性，且其浓度与细胞抑制率明显相关；（２）ＣｓＡ的增效作用与ＶＰ相似，当ＣｓＡ与ＶＰ及ＡＤＭ合用时，对ＭＧＣ的抑制达到相加的效果。     

人源性抗HER2胞外段Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建全人源抗HER2胞外段(HER2 ECD)噬菌体Fab抗体库,从中筛选出特异性的抗体,并对其进行鉴定。方法:体外致敏并用EB病毒(EBV)转化HER2高表达乳腺癌患者的外周血单核细胞(PBMC),用PCR分别扩增重链Fd和轻链κ/λ基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建抗HER2 ECD人源化Fab噬菌体抗体库。以纯化HER2 ECD蛋白为抗原进行3轮固相淘选,富集抗HER2 ECD的抗体,并随机挑选克隆进行ELISA,获得的阳性克隆进一步以Western blot鉴定其抗原结合活性,对其中活性最高的克隆进行DNA测序。结果:构建了容量为2.5×107的抗HER2 ECD的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了4株与HE2 ECD特异性结合的阳性克隆,Western blot分析显示其与HER2 ECD能较好的结合。选取结合活性最高的阳性克隆进行DNA序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。结论:成功构建了全人源抗HER2 ECD噬菌体抗体库,并筛选出抗HER2 ECD特异性较强的噬菌体克隆,为获得新的有临床应用价值的HER2 ECD抗体提供了实验基础。     

微小RNA-218在鼻咽癌中的表达及其临床意义

目的:检测微小RNA-218(microRNA-218,miR-218)在鼻咽癌组织中的表达情况,并探讨其临床意义.方法:收集鼻咽癌活检组织标本54例,同时以35例正常及慢性炎性反应鼻咽黏膜活检组织作为对照,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RFQ-PCR)法检测鼻咽癌组织及对照组织中miR-218的表达情况,分析miR-218表达水平与鼻咽癌临床病理参数之间的关系,以及与患者预后的关系.结果:与对照鼻咽黏膜组织相比,miR-218在鼻咽癌组织中的表达水平普遍下调.鼻咽癌组织中miR-218平均表达量明显低于对照鼻咽上皮组织,差异有统计学意义(P=0.000).miR-218表达水平在低分化鼻咽癌组织明显低于高/中分化鼻咽癌(P=0.032),临床Ⅲ/Ⅳ期鼻咽癌组织明显低于临床Ⅰ/Ⅱ期鼻咽癌(P=0.007),有转移的鼻咽癌组织明显低于无淋巴结转移的鼻咽癌(P=0.019).Kaplan-Meier生存分析发现,miR-218表达水平越高,患者生存时间越长(P＜0.05).结论:miR-218与鼻咽癌的发生、临床进展及预后密切相关,它可能成为鼻咽癌新的潜在的治疗靶点及诊断预后分子标志物.     

EB病毒LMP1促鼻咽上皮细胞增殖的蛋白分子鉴定

目的： 探讨EB病毒潜伏性膜蛋白 1(LMP1)促鼻咽上皮细胞增殖的分子机制。方法: 采用逆病毒感染的方法,将浓缩的逆病毒RV-pLNSX(空载体)和RV-LMP1分别感染鼻咽上皮细胞NP69,建立NP69-pLNSX与NP69-LMP1稳定表达细胞系,通过绘制细胞生长曲线、平皿克隆形成实验和软琼脂集落形成实验检测LMP1对NP69细胞增殖的影响;运用比较蛋白质组学方法鉴定LMP1在NP69细胞中参与调节的蛋白,并对部分蛋白表达进行验证。结果: (1) LMP1具有促鼻咽上皮细胞NP69增殖的作用(n=3,P<0.05)。(2) 鉴定了22个LMP1参与调节NP69细胞的蛋白(表达上调的蛋白9个,下调的13个),实时荧光定量RT-PCR和Western blotting证实了部分上述蛋白的差异表达。结论: LMP1可能通过参与调节keratin 19和vimentin等蛋白的表达促鼻咽上皮细胞NP69增殖。     

EBV-LMP1促CNE2细胞迁移的作用机制

目的：探讨EBV-LMP1对鼻咽癌细胞CNE2迁移表型的影响及作用机制。方法：用RV-LNSX,RV-LMP1和RV-LMP1^TRADD。逆转录病毒分别感染CNE2细胞,G418筛选后,观察和检测转基因细胞的形态学特点,在基质中的运动迁移能力以及R-钙黏蛋白（E-Cadherin）表达的变化;用pLNSX,pLNSX-LMP1和pLNSX—LMPI^TRADD质粒分别与E-Cadherin报告基因共转染293细胞,检测LMP1对E-Cadherin启动子活性的影响。结果：与CNE2和CNE2-LNSX细胞相比,CNE2-LMP1在培养过程中由扁平、鹅卵状上皮细胞形态逐渐演变为细胞间接触消失的长梭状纤维细胞形态,相对迁移明显增大（n=3,P〈0.05）。且E-Cadherin表达明显下调或缺失;随着共转染野生型LMP1（pLNSX-LMP1）剂量的增加（0．2,0、6,1．0μg）,对E／-Cadherin启动子转录活化的抑制率增加,呈明显浓度依赖性;LMPI^TRADD不改变CNE2细胞形态学及迁移表型,对E-Cadherin启动子的转录活性及蛋白表达亦无明显影响。结论：抑制E-Cadherin启动子活化可能是EBV-LMP1下调E-Cadherin蛋白表达、促CNE2细胞迁移的机制之一,位于LMP1羧基端的TRADD可能是其促迁移的主要活性部位。     

环孢素A对阿霉素细胞毒性的体外增效作用

探讨了环抱素Ａ（ＣｓＡ）对阿霉素（ＡＤＭ）作用于人体胃低分化粘液腺癌细胞系（ＭＧＣ）的增效作用，并与戊脉安（ＶＰ）的增效作用进行了比较。发现：①低浓度ＣｓＡ能增强ＡＤＭ对ＭＧＣ细胞系毒性（Ｐ＜０．０１），且其浓度与细胞抑制率明显相关（ｒ＝０．９９８６，Ｐ＜０．０１）；②ＣｓＡ的增效作用与ＶＰ相似（Ｐ＞０．０５），当ＣｓＡ与ＶＰ及ＡＤＭ合用时，对ＭＧＣ的抑制达到相加的效果（Ｐ＜０．０１）。     

EB病毒对人胚鼻咽上皮细胞的转化

为观察EBV和／或促癌物四癸酸佛波醇二酯（TPA）对其的转化作用，以人胚鼻咽上皮作体外原代组织培养，采用自B95－8细胞分离的EB病毒直接感染或结合TPA处理体外培养的人胚鼻咽上皮细胞，着重观察感染细胞在半固体培养基中的集落形成率；并采用PCR扩增法探讨EB病毒是否直接进入鼻咽上皮细胞。结果显示：单独EB病毒或灭活（56℃，30分钟）EB病毒加TPA感染时，病毒不能进入细胞导致表型改变；活性EB病毒结合TPA同时处理或先用EB病毒后用TPA处理时，EB病毒能直接进入细胞并导致细胞集落形成率明显增高（P＜0．05）。从而表明EB病毒体外能部分转化人胚鼻咽上皮细胞，其转化作用依赖于TPA的存在和病毒基因组的完整。     

miR-216b通过靶向调控蛋白激酶Cα基因的表达抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭

目的 明确miR-216b是否通过靶向调控蛋白激酶Cα(PKCα)基因的表达来抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭.方法 构建PKCα 3'非编码区(UTR)-荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告系统检测miR-216b对PKCα 3'UTR-荧光素酶活性的影响.将miR-216b模拟物转染鼻咽癌细胞CNE2,采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测PKCα mRNA和蛋白的表达水平.将PKCαsiRNA转染CNE2细胞,通过MTS细胞增殖实验和Transwell侵袭实验观察PKCα基因表达下调对CNE2细胞增殖和侵袭的影响.将PKCα重组质粒与miR-216b模拟物共转染CNE2细胞,通过MTS细胞增殖实验检测CNE2细胞的增殖能力.结果 双荧光素酶报告检测结果显示,miR-216b能特异性地与PKCα mRNA的3'UTR结合,下调荧光素酶活性,其活性约为转染对照模拟物细胞的62.4％.过表达miR-216b的CNE2细胞中PKCα mRNA和蛋白的表达水平均降低,与对照细胞比较,分别降低49.1％和55.7％.siRNA干扰PKCα表达能抑制CNE2细胞的增殖和侵袭能力,能部分模拟miR-216b的抑瘤功能.过表达PKCα能部分逆转miR-216b对CNE2细胞的增殖抑制作用.结论 miR-216b通过靶向调控PKCα基因的表达来抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭.     

家兔MT—I基因克隆及其在大肠杆菌中的表达与分离

采用 RT- PCR方法扩增镉诱导后的家兔肝脏金属硫蛋白 - I(Metallothionein- I,MT- I)基因的 c DNA全长 ,克隆入原核融合表达载体 p QE4 0 ,转化大肠杆菌 M15。菌落印迹法检测阳性菌株 ;Western blotting分析重组融合蛋白的表达方式 ;经 SDS- PAGE电泳后 ,Im age Master VDS software分析融合蛋白诱导表达条件 ;并采用 Ni-NTA agarose纯化融合蛋白。结果发现 ,重组融合蛋白在原核细胞中表达存在可溶和不可溶 (包涵体 )两种形式 ,表达量随 IPTG诱导时间延长而增加 ,9h达高峰 (占菌体不溶性蛋白总量的 5 7.4 % ) ,经 Ni- NTA亲合层析纯化得到重组融合蛋白 ,为进一步分离目的蛋白单体并研制和开发这一产品提供了可靠依据