冻存复苏后大鼠视网膜干细胞的增生及分化特性

目的研究视网膜干细胞冻存复苏后的成活率及再培养后的增生分化特性。方法对胎龄17 d Long Evans的大鼠眼视网膜干细胞进行分离与体外培养。利用无血清培养基短期体外培养大鼠胚胎来源的视网膜干细胞，将传代三代后的视网膜干细胞以冻存液［体积分数为80%的改良基础培养基（DMEM）/F12，10%牛血清白蛋白（BSA），10%二甲基亚砜（DMSO），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）20 ng/ml］于液氮中冻存，于1、2、4、8、12、16周分别复苏，计数活细胞比例进行再培养，并进一步诱导分化，采用免疫细胞荧光化学方法检测视网膜干细胞的增生及分化特性。结果不同的冻存时间对冻存后细胞存活率的影响无显著差异(P＞0.05)，再培养生长良好，具有视网膜干细胞特异性标志，并可进一步诱导分化为视网膜各种类型的细胞。结论大鼠视网膜干细胞的冻存复苏并不影响其原有的增生及分化特性。(中华眼底病杂志, 2007, 23: 94-97)     

人胚胎视网膜短期、中期及长期保存的实验研究

目的 观察全层人胚胎视网膜的短期、中期及长期保存后的活性和结构。 方法12~24周全层人胚胎视网膜22例分为88片，明胶包被后分别行Ames液、中期保存液(DX角膜保存液)、-80 ℃、程序深低温4种方法保存不同时间后，台盼蓝染色观察视网膜神经上皮层活细胞百分率，光学显微镜和透射电子显微镜观察视网膜组织结构。 结果 人胚胎视网膜在新鲜取材时活细胞占(94.79±2.85)%；短期保存在Ames液4 h内活细胞百分率大于80%，中期保存在DX液1~2 d时活细胞百分率大于77%，均与新鲜取材时活细胞百分率无显著差异。-80 ℃保存7 d时活细胞百分率为(65.83±5.06)%，1个月时降至(57.54±16.18)％；深低温长期保存1个月时活细胞百分率为(69.46±9.31)%。全层人胚胎视网膜保存在Ames液2 h时光学显微镜和电子显微镜检查均未见明显异常；在DX液中2 d、-80 ℃7d和深低温1个月时光学显微镜检查见其层次清楚，但细胞间隙加大，组织排列疏松。 结论 全层人胚胎视网膜在Ames液和DX角膜保存液中可于一定时间内保持较好的活性和组织结构。     

兔角膜撕裂伤伤口无创黏合和传统缝合的对比研究

目的 探讨a-氰基丙烯酸正辛酯为主体的医用化学组织黏合剂治疗兔眼角膜全层裂伤的可行性.方法 35只成年兔平均随机分为3 d组、7 d组、14 d组、30 d组、90 d组,建立经角膜的穿通伤模型,右眼用医用胶黏合,左眼缝线缝合,观察术后医用胶的降解,对比研究角膜伤口大体和组织病理学愈合情况.结果 术中医用胶迅速密闭角膜伤口.术后3 d,2组均可见部分兔眼角膜混浊.术后 7 d,2组兔眼角膜均出现新生血管,医用胶组较缝线组严重,术后30 d缝线组大部分消退,医用胶组角膜均残留2～3支新生血管.术后 90 d 2组新生血管基本吸收,医用胶脱落,角膜伤口均可看见线状白斑.组织病理学检查光镜示缝线组术后早期角膜伤口炎细胞浸润,角膜上皮植入;医用胶组术后早期炎细胞浸润不明显,无角膜上皮植入.术后30 d 2组角膜伤口成纤维母细胞和炎细胞均明显减少,纤维细胞增多.术后90 d伤口组织愈合.结论 医用胶可有效治疗角膜穿通伤.     

正常大鼠视网膜电图振荡电位的频谱特性分析

背景暗适应视网膜电图（ERG）的振荡电位（OPs）在多种视网膜疾病的视功能评价中发挥重要作用,但其波形的确切起源尚未完全明确。OPs波的时域和频域分析及其影响因素的研究对进一步研究OPs的发生和起源具有重要意义。目的观察正常大鼠的暗适应ERGOPs与刺激光强度和动物年龄的关系。方法选择出生后21、25、32、35、37、46、60及90d的RCS—rdy^＋-P^＋大鼠各3只,采用RETI—scan记录系统进行闪光视网膜电图（F—ERG）OPs波记录,记录电极为环形角膜电极,参考电极为不锈钢针状电极,刺激强度分别为-20、-10、-5、0、5dB,通过Matlab提取OPs成分,分析其频谱特性。结果上述各种刺激强度下不同年龄组大鼠OPs的最大能量振幅值对应的频率值（即主频）范围为80～120Hz。随着刺激光强度的增加,开始出现高频（200—250Hz）成分,对应的振幅值随着刺激光强度的增加而增加;低频成分,即主频随着刺激光强度的增加其对应振幅值出现先升高后下降的趋势;当刺激光强度达到0dB时,低频成分出现双峰现象。25日龄大鼠OPs主频振幅最小,60日龄大鼠OPs主频振幅最大;25日龄大鼠OPs主频的带宽最窄,60日龄大鼠OPs主频的带宽最宽。结论大鼠ERG的OPs频域特性分析说明,刺激光强度对大鼠OPs振幅产生正向的影响,而大鼠的年龄主要影响OPs的主频分布。     

RCS大鼠病变过程中视网膜电图振荡电位的频域特性分析

目的 观察皇家外科学院大鼠(royal college of surgeons,RCS)视网膜变性过程中的暗适应视网膜电图(electroretinogram,ERG)振荡电位(oscillatory potentials,OPs)频域特性.方法 选择出生后20、30、40 d及60 d的RCS大鼠各3只,采用RETI-sean记录系统进行闪光视网膜电图(flash electroretinogram,F-ERG)OPs记录,记录电极为环形角膜电极,参考电极为不锈钢针状电极,刺激强度为0dB,通过Matlab提取OPs成分,分析其频谱特性.结果 相对于同龄的正常大鼠,RCS大鼠OPs频域幅值明显重度降低(P＜0.01),且高频成分缺失.RCS大鼠发育过程中,随着病程进展至40 d时对应的频率向高频部分明显延迟(P＜0.05),进展至60d时其频域幅值明显降低(P＜0.05).结论 RCS大鼠ERG的OPs频域特性与视网膜功能的变性程度存在相关性,利用这些特性可以更明显观察到视网膜变性对大鼠视网膜功能的影响.     

视网膜色素上皮变性大鼠随生长发育的视网膜电图改变

背景RCS—rdy-P’大鼠随着生长发育会逐渐发生视网膜色素变性（RP）,记录其生长发育过程中的视网膜电图（ERG）改变可为该模型鼠的进一步研究奠定基础。目的观察RCS—rdy-P’大鼠视网膜发育过程中的ERG变化,研究ERG随发育的变化特点。方法采用RETI-port系统、环形角膜电极和不锈钢针状电极分别记录生后21、32、37、45、60d的RCS-rdy-P’大鼠的系列暗适应ERG,每个年龄组6只鼠。取相同时间点及数量的同种系正常的RCS-rdy-P’大鼠作为正常对照。暗适应不同时间的ERG对比采用RCS-rdy＋P’生后60d大鼠共9只,每组3只。结果在刺激光强、刺激频率、体温相同的情况下,RCS-rdy-P’大鼠ERGb波振幅与暗适应时间有关,随着暗适应时间的延长,b波振幅增加,当暗适应时间超过12h时,即使暗适应时间增加,b波振幅不再增长,说明暗适应超过12h可以得到RCS-rdy＋-P’大鼠一个较为稳定的ERG波形。与RCS—rdy＋一P’大鼠比较,RCS—rdy-P’大鼠在生后21d时ERG已出现a波、b波振幅的下降,同时隐含时明显延长,以a波改变为主。随着RCS—rdy-P’大鼠年龄增长及RP的进展,ERGa波、b波振幅进一步下降,隐含时延长,RCS—rdy-P’大鼠生后60d时,其ERG反应记录不到。对照组大鼠在21d时,ERG的a波、b波均振幅较低;生后32d时RCS—rdy-P’大鼠b波振幅增加,但隐含时缩短;到生后45d仅小幅增加,45～60d再次出现b波振幅显著增加,隐含时缩短。结论RCS—rdy一一P’大鼠随着年龄的增长发生视网膜功能的变化,其暗适应ERG改变符合RP的进展过程。     

大鼠视皮层两类神经元的NMDA及GABAA受体介导的突触后电流电学特性研究

目的 在视觉发育可塑性关键期内,探讨大鼠视皮层神经元的细胞类型与兴奋性和抑制性突触后反应的关系.方法 对出生后14～28 d龄正常大鼠进行视皮层脑片膜片钳全细胞记录,分别采用神经药理学方法分离和记录谷氨酸和N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体介导的兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents, EPSCs)以及γ-氨基丁酸(galnma-aminobutyric acid,GABAA)受体介导的抑制性突触后电流(inhibitory postsynaptic currents,IPSCs),并进行神经元细胞内标记、免疫细胞化学染色.结果 锥体细胞和颗粒细胞的NMDA受体介导的EPSCs峰值、上升时间、下降时间及NMDA/谷氨酸电流比率并无显著性差异(P＞0.05);锥体细胞GABAA受体介导的IPSCs下降时间较颗粒细胞的短(P＜0.05),而峰值和上升时间并无显著性差异(P＞0.05).结论 在视觉发育可塑性关键期内,GABAA受体在大鼠视皮层不同神经元的突触传递中可能发挥不同的作用,而NMDA受体在不同神经元的突触传递中具有同质性.     

小型猪多焦视网膜电图的记录方法及特点

目的 研究小型猪多焦视网膜电图（multifocal electroretinogram,mfERG）的记录方法及特点.方法 应用罗兰电生理系统中的RETI scan软件对5只小型猪正常眼行mfERG检查,记录波形成分并进行统计学处理.结果 对P1波各项指标进行统计学分析见第1～6环反应密度逐渐下降,波幅值逐渐升高;N1波幅值和潜伏期差异无统计学意义（P＞0.05）;P1波上半野反应密度和波幅值较下半野高,峰潜时值较短;N1波上半野波幅值较下半野高,峰潜时值较长.结论 应用mfERG对实验动物进行检查,可以客观评估动物视网膜后极部功能变化.     

兔健眼角膜缘干细胞取材安全范围的实验研究

目的 确定自体角膜缘干细胞移植健眼取材的安全范围,为临床治疗提供实验依据.方法 兔眼角膜按30°、60°、90°等依次递增至210°分组切取角膜缘干细胞组织,术后不同时间点裂隙灯下动态观察每组角膜混浊、角膜上皮染色、新生血管3项临床指标,角膜上皮印迹细胞学检查及HE染色观察角膜上皮的细胞表型和病理学改变.结果 兔眼角膜缘切取范围大于150°时,出现角膜混浊,上皮持续缺损及新生血管长入,临床指标评分比较,差异有统计学意义(P＜0.01).印迹细胞学检查显示PAS阳性的结膜细胞.组织病理学可见角膜缘上皮细胞层次减少和新生血管.结论 自体角膜缘干细胞移植健眼的取材范围≤150°(相当于5个钟点位)是安全的.切取范围＞150°时角膜缘干细胞可能出现不可逆的失代偿.印迹细胞学检查是诊断角膜缘干细胞缺乏简单有效的方法.