碱性成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白在Origami2体系中的可溶表达及二者促成骨的协同效应

目的 建立优化高效的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein,BMP-2)蛋白重组方法,阐明二者在促成骨中的协同效应.方法 优化bFGF和BMP-2成熟肽的基因序列密码子,获得适用于大肠杆菌Origami2体系表达的bFGF及BMP-2成熟肽cDNA片段;利用PCR法将bFGF成熟肽cDNA片段插入原核表达质粒pColdⅡ中,构建重组原核表达质粒pColdⅡ-bFGF;利用PCR法将BMP-2成熟肽cDNA片段插入原核表达质粒pET-30a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-30a(+)-BMP-2,转入大肠杆菌Origami2中表达纯化;运用双酶切、质粒测序及Western blot技术证明Origami2表达体系的构建效果;进行细胞增殖实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)染色观察和体内成骨效率检测等,探索bFGF、BMP-2在促成骨中的协同效应.结果 双酶切和质粒测序鉴定证明成功构建重组大肠杆菌pColdⅡ-bFGF/Origami2和pET30a(+)-BMP-2/Origami2表达体系,Western blot检测发现蛋白正确表达.经过Ni-NTA亲和层析纯化后bFGF及BMP-2纯度高达90％.通过对二者比例的优化筛选,发现40 ng/mL bFGF +40 ng/mL rhBMP-2时,大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖效率、ALP活性及体内成骨效率最高,是二者促成骨的最优效组合.结论 成功构建高效表达的pCold Ⅱ-bFGF/Origami2和pET30a(+)-BMP-2/Origami2表达体系,实现了bFGF及BMP-2的高效表达.bFGF和BMP-2的优化联合应用具有促成骨协同效应.     

内毒素直接作用于血管内皮细胞激活信号分子的研究

目的：对内毒素（LPS）直接作用于血管内皮细胞（VECs)激活的多种信号通路的主要激酶及转录因子进行筛选研究。方法：10ng.ml^-1浓度的LPS刺激细胞至预定时相点后,用免疫细胞化学观察信号分子的磷酸化和／或核转位,结果：LPS直接作用于VECs在5－15min内即可观察到多种信号分子的激活,随刺激时间延长,信号分子激活程度逐步增,至一定时相点后活性又消失,这些信号分子的活性在持续时间上存在一定的差异。这些激活的信号分子包括p38、ERK1／2MAPK、CREB、STAT5、STAT6、NF－kB家庭成员p65、p50、p52、c-Rel、Rel-B等。结论：LPS直接作用于VECs可以迅速激活多种信号分子,诱导信号分子的磷酸化和／或核转位。LPS诱导的CREB磷酸化、不同NF－kB家族成员核转位持续时间的差异是第一次报道。     

人β1整合素近端和远端启动子报告基因载体的构建和鉴定及启动活性分析

目的：克隆整合素β1近端启动子和远端启动子基因序列，构建并鉴定整合素β1启动子调控的荧光素酶报告基因载体pGL3—261和pGL3—1442。方法：以本室构建的含整合素β1全长启动子基因序列（1756bp）的重组载体pGL3—β1为模板，用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1近端和远端启动子基因序列，克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic，构建含正确目的基因的表达载体pGL3—261和pGL3—1442，经Nhe I、Xho I酶切、聚合酶链式反应（PCR）扩增及测序鉴定；并用pGL3—261和pGL3—1442质粒与pGL3—β1质粒同时转染人表皮细胞株HaCaT进行活性分析。结果：酶切及序列测定表明，克隆获得的近端启动子261bp和远端启动子1442bp与GenBankDNA序列数据库对比分析序列一致，且插入方向正确；此三种质粒都有明显的启动子活性，远端启动子活性与全长启动子活性无显著差异，但明显高于近端启动子活性。结论：成功构建了整合素B1近端和远端启动子基因序列荧光素酶报告基因载体，整合素β1远端启动子在HaCaT细胞中起主要作用。为下一步研究人整合素β1启动子核心区、基因表达调控机制及其信号转导通路等奠定基础。     

中西医结合治疗泌尿系统结石疗效观察

目的:观察中西医结合治疗泌尿系统结石的临床疗效。方法:对240例泌尿系结石患者随机分为治疗组和对照组,治疗组给予中西医结合治疗,对照组予以西医对症治疗,两组均以两周为1个疗程,共治疗2个疗程。结果:中西医结合治疗组总有效率为95%,对照组总有效率70%,两组总有效率比较,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:中西医结合治疗泌尿系统结石疗效肯定,是治疗泌尿系结石理想方法。     

小切口原位低温下肾动脉阻断治疗复杂性肾结石34例

目的探讨开放性手术治疗复杂性肾结石的手术方法。方法对34例复杂性肾结石患者采用静脉注射肌苷2．0g,原位低温下阻断肾动脉后行肾实质切开取石术。手术前后检查包括KUB、IVP、CT、B超、血BUN、Cr等,术后随访。结果34例手术均顺利完成,结石一次取净32例,2例残留结石经ESWL治愈。手术时间90～150min,平均110min;肾动脉阻断时间20～90min,平均40min;出血量100—450ml,平均150ml。术后并发出血1例,经保守治疗治愈,术后无并发症,随访6～24个月,患肾功能恢复良好。结论小切口原位低温下阻断肾动脉配合静脉注射肌苷行肾实质切开取石手术具有方法容易掌握、出血少、创伤小、肾功能损害小、手术安全等特点,是治疗复杂性肾结石安全、有效的方法之一,易于在无条件行微创手术的医院开展。     

分化抑制因子1相互作用蛋白AGGF1的筛选

目的 利用酵母双杂交方法,筛选成人肺组织文库中与分化抑制因子1(Id1)相互作用的蛋白.方法 PCR方法扩增Id1的编码序列并定向克隆入诱饵质粒pHybLex/Zeo,构建重组诱饵质粒pHybLex/Zeo-Id1,酶切鉴定后转化人酵母株EGY48/pSH18-34,检测重组诱饵质粒有无非特异激活报告基因Leu2、LacZ作用;扩增并提取成人肺组织文库质粒,将文库质粒及重组诱饵质粒转化入酵母细胞,依次筛选Leu2 ,Leu2 LacZ 克隆;设置阴性及阳性对照,重复筛选Leu2 LacZ 克隆并排除假阳性克隆,获取真阳性文库质粒,进行测序和同源性比对.结果 酶切证实,重组诱饵质粒构建成功.重组诱饵质粒转化入酵母细胞后.经检测无非特异激活报告基因作用.扩增并筛选成人肺组织文库.获得198个Leu2 及19个Leu2 LacZ 克隆.经排除假阳性克隆,最终获得1个Leu2 LacZ 真阳性克隆,经测序和同源性比较证实该克隆与蛋白AGGF1高度同源(556/559,99.5%),Westem blotting证实其在酵母细胞中有表达.结论 利用酵母双杂交方法,通过筛选成人肺组织文库,发现Id1与AGGF1存在相互作用.     

重组溶葡萄球菌蛋白的原核表达、纯化及生物学活性研究

目的 原核表达重组溶葡萄球菌蛋白并检测其杀菌效力.方法 在成熟溶葡萄球菌蛋白编码序列的基础上,设计重组序列,采用PCR技术扩增,克隆至大肠埃希菌表达载体,IPTG诱导表达,用微量稀释法研究其对金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)的杀菌效果.结果 目的DNA片段克隆至表达载体后经测序鉴定正确,在大肠埃希菌中获得高效表达,经免疫印迹鉴定重组蛋白表达正确.重组溶葡萄球菌蛋白对金葡菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)均小于传统抗生素.结论 成功表达重组溶葡萄球菌蛋白,其对金葡菌有强大的杀菌效力.     

E-box元件在p21基因表达调控中作用的研究

目的：通过p21基因调控序列E-box位点的突变分析,研究E-box位点对p21基因表达调控的作用。方法：将人野生型p21基因启动子全长序列构建到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic,并进一步对重组载体pGL3-p21p启动子E-box位点做定点突变,构建突变载体E1、E2、E3,分别转染人脐静脉血管内皮细胞株（ECV304细胞）,DLR系统测定荧光素酶活性,并观察E-box位点突变前后荧光素酶活性变化。结果：测序结果表明野生型pGL3-p21p及突变载体E1、E2、E3构建成功。野生型pGL3-p21p荧光素酶活性（105.82±16.55）明显高于空载体pGL3-basic（1.56±0.62）;突变载体E1、E2、E3的荧光素酶活性（70.71±16.46、37.87±3.26、83.25±11.48）较野生型载体不同程度下降（P〈0.01）。结论：p21基因启动子某些E-box位点参与了p21基因的表达调控。     

高龄人群大肠肿瘤连续普查随防的意义

目的 了解高龄人群大肠癌普查的意义。方法 被查对象在不限制饮食的条件下留取晨起粪便20g,以序贯法进行隐血(SOB)检查。1994年以后加做粪免疫白蛋白(MA)试验,筛检阳性者均进行全结肠镜检查,发现大肠癌的均行手术切除,大肠腺瘤均在肠镜下行电切并每年内镜随访。结果 SOB阳性232人,其中大肠癌3例,临床分期为DUKES'B期2例,DUKES'A期1例。大肠腺瘤130例,有9例间期癌,临床分期以C、D期为多。MA阳性者137例,合并隐血阳性的大肠癌2例,均为间期癌。结论 每年高龄人群SOB、MA普查有一定意义,及时对大肠腺瘤行干涉治疗对高龄人群大肠癌的预防有重要意义。     

hTERT基因荧光真核表达载体的构建及表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位(hTERT)正、反义荧光真核表达载体,并检测其在人胚胎成纤维细胞中的表达．方法：采用基因重组技术,将hTERT cDNA正向克隆到荧光真核表达载体pIRES2-EGFP中,NotI酶切鉴定;采用脂质法,将重组基因pIRES2-EGFP-hTERT转染入原代培养的人胚胎成纤维细胞;采用激光共聚焦显微镜、RT-PCR及Western blot检测hTERT在胚胎成纤维细胞中的表达．结果：经NotI酶切后,hTERT正义重组质粒被切成1．4kb和7．4kb2个片段,反义重组质粒为4．8kb和4．0kb2个片段,与理论预期长度相符;pIRER2-EGFP-hTERT重组基因经脂质法转染,G418筛选,获得一个阳性克隆,激光共聚焦显微镜下可见明显的绿色荧光,RT-PCR及Western blot可见hTERT mRNA转录及其蛋白的表达。结论：成功构建了h TERT正义荧光真核表达载体,并可在人胚胎成纤维细胞中表达。