一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法

目的 建立一种改良的亚硫酸氢盐修饰微量DNA的甲基化分析方法.方法 应用低熔点琼脂糖包埋不同含量的DNA,进行亚硫酸氢盐修饰,通过MGMT基凶甲基化与非甲基化特异PCR的扩增,与传统的亚硫酸氢盐修饰法进行分析比较.结果 改良法对于低至15.625ng的DNA修饰均可获得MGMT基因甲基化扩增产物,而传统法对于62.5ng及其以下的DNA修饰难以获得MGMT基因甲基化扩增产物.结论 改良的亚硫酸氢盐修饰方法可有效提高甲基化特异PCR的灵敏度,该方法为微量DNA的甲基化分析提供了一种较理想的研究手段.     

L-02肝细胞对氢醌所致DNA损伤耐受实验模型的初步建立

目的确定氢醌（hydroquinone,HQ）对L-02肝细胞的染毒剂量和染毒时间,从而为进一步的DNA损伤耐受机制研究提供科学依据。方法采用噻唑蓝（MTT）比色法测定不同浓度（0、5、10、20、40、80、160和320umol／L）的HQ于不同时间（6、12、24和48h）作用之后L-02肝细胞的相对存活率。结果在相同的作用时间（6、12或24h）条件下,在0-320umol／L范围内,随着HQ浓度的增加,各剂量组L-02肝细胞的存活率以剂量依赖性方式逐渐减少;其中160和320umol／L组L-02肝细胞的存活率与对照组相比较有明显地减少（P〈0．01）;而在48h时间组内,HQ染毒剂量达到80umol／L就可引起L-02肝细胞存活率的明显降低（P〈0．01）。在相同浓度（5、10、加和40umol／L）的HQ作用下,随着HQ作用时间的延长,各剂量组细胞的存活率之间差异没有统计学意义（P〉0．05）;当HQ染毒时间达到48h时,80、160和320umol／L的HQ染毒组L-02肝细胞的存活率与6h对照组比较有明显地减少（P〈0．01）。结论可以将80umol／L的HQ染毒24h作为L-02肝细胞耐受DNA损伤的最大剂量和最长时间的界限。     

人胚肺成纤维细胞衰老过程中P66Shc启动子区组蛋白修饰变化

目的检测体外培养的人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中及过氧化氢诱导细胞早衰阶段P66Shc启动子区的组蛋白修饰变化。方法按传代情况将人胚肺成纤维细胞分为年轻细胞(22 population doubling levels,22PDL)组、中年细胞(35PDL)组、复制性衰老细胞(49PDL)组和氧化应激诱导的早衰细胞(premature senescence,PS)组。检测P66Shc的mRNA表达及其启动子区IP1、IP2组蛋白修饰,包括组蛋白H3、H4乙酰化和H3(Lys4)甲基化修饰。结果与年轻细胞组比较,中年细胞组、复制性衰老细胞组和早衰组人胚肺成纤维细胞P66Shc mRNA表达水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。在P66Shc IP1启动子区(-1 641～-1 392 bp),中年细胞组和复制性衰老细胞组以H4乙酰化修饰为主,而早衰细胞组受H3、H4乙酰化和H3(Lys4)甲基化的联合修饰;在P66Shc IP2启动子区(-129～45 bp),中年细胞组和复制性衰老细胞组受H3(Lys4)甲基化修饰,而早衰细胞组受H4乙酰化和H4(Lys4)甲基化联合修饰。结论在细胞衰老过程中,P66Shc启动子区的组蛋白修饰参与其mRNA表达调控,复制性衰老与早衰的调控机制存在差异。     

结晶型NiS诱发人支气管上皮细胞系恶性转化

目的:研究结晶型硫化镍(NiS)诱发SV-40 Large T抗原永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化作用.方法:体外用不同浓度结晶型NiS多次处理16HBE细胞,软琼脂集落形成和裸鼠成瘤试验鉴定转化细胞的恶性度.结果:细胞培养至35代,发现NiS可诱导16HBE恶性转化.转化细胞排列紊乱,重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P＜0.01),并呈时间剂量依赖关系;转化细胞在裸鼠体内成瘤,组织学证实为低分化鳞状细胞癌.结论:结晶型NiS有较强的诱导人支气管上皮细胞恶性转化能力；该转化模型为镍致癌机制的分子水平研究提供了理想的研究系统。     

DNA氧化损伤在肺癌发生中的作用

目的:为探明DNA氧化损伤在人群肺癌发生中的作用及其分子机制而进行本研究。方法:使用针对DNA经受氧化损伤标志物8-羟基-脱氧鸟苷(8-OH-dG)的鼠抗人单克隆抗体,通过免疫学方法检测150例肺癌、120例癌旁肺组织、40例肺良性病变和40例正常肺组织中DNA氧化损伤标志的含量;同时检测相应肺组织中P53、C-MYC、K-RAS、BCL-2、hTERT等癌变相关基因的表达,分析DNA氧化损伤与上述癌变相关基因表达的关系;并在B(a)P-7,8二醇-9,10环氧化物(BPDE)和NiS诱导的体外人气管上皮细胞癌变模型上检测癌变过程中DNA氧化损伤的变化。结果:肺癌组织、癌旁肺组织、肺良性病变和正常肺组织氧化损伤标志物8-OH-dG的阳性率分别为92.7％(139/150)、17.5％(21/120)、10.0％(4/40)和5.0％(2/40),肺癌的氧化损伤高于其他肺组织(P<0.01)。按性别、年龄、细胞类型和吸烟史分层,未见其与DNA氧化损伤之间的关联。分析DNA氧化损伤与癌变相关基因的关系,发现肺癌组织K-RAS、BCL-2基因的过度表达与DNA氧化损伤的含量高有关,而P53、C-MYC和hTERT基因表达与DNA氧化损伤无关联。在体外用BPDE和NiS作用于人气管上皮细胞系诱导其转化和癌变过程中,DNA氧化损伤标志8-OH-dG出现于细胞转化之前,其量与细胞癌变进程相一致。结论:DNA氧化损伤在肺癌变的过     

双向电泳分析结晶型NiS诱发人支气管上皮细胞恶变后的蛋白表达差异

[目的]建立双向凝胶电泳分析方法，比较结晶型NiS诱发入支气管上皮细胞恶变后的蛋白表达差异。[方法]采用一步法分别提取人支气管上皮细胞系16HBE细胞和结晶型NiS诱发该细胞系的恶性转化细胞N-2细胞的可溶性总蛋白，经双向凝胶电泳分离、银染显色、用双向电泳凝胶图像分析软件ImageMaster2D3．10分析两者之间可溶性蛋白的差异表达。[结果]获得了分辨率和重复性较好的双向电泳银染图谱。图像分析显示在恶性转化细胞中检测到19个新的蛋白点，同时有47个蛋白点消失，有140个蛋白点在两种细胞中表达量有显著差异，其中89个蛋白点在N-2细胞中表达升高，51个蛋白点在N-2细胞中表达降低。[结论]双向电泳技术分析NiS诱发细胞恶性转化后蛋白质组发生了变化，这将为镍致癌相关的蛋白的研究和鉴定奠定基础。     

NBSl基因8360G〉C（Glul85Gln）多态位点与南方人群肺癌的相关性

目的：研究DNA双链断裂修复基因NBSl编码区8360G〉C（Glul85Gln）多态与我国南方人群肺癌发病的关联。方法：应用病例对照研究方法，采用PCR—RFLP技术检测300例肺癌患者与正常对照8360G〉C多态位点的基因型．用SAS9．13软件分析该位点变异与肺癌发病的关系。结果：NBSl的8360G〉C基因型频率在肺癌与对照中的分布差异有显著性（P：0．0230）；携带GC变异基因型个体发生肺癌的危险性是GG基因型携带者的1．28倍（adjustedOR=1．28；95％CI：1．04—1．59；P：0．025），携带cc变异基因型个体的危险性则是1．93倍（adjustedOR=1．89；95％CI=1．43—2．5l；P〈0．001），且存在显著的等位基因剂量一效应关联（Ptrend=0．0049）。结论：NBSl编码区8360C变异基因型与我国南方人群肺癌发病有关，它可能是我国南方人群肺癌发病的一个遗传相关因素。     

饮用水源及自来水有机提取物的类雌激素活性分析

目的了解某市饮用水源及自来水中类雌激素污染物的活性现状。方法在饮用水源上、中、下游监测断面，分别于枯水期（1月份）和丰水期（7月份）对饮用水源进行采样，同时采集城区自来水样。运用装有XAD-2树脂玻璃柱对水样中的有机物进行抽提，并以DMSO定容；实验室运用人类乳腺癌细胞（MCF-7）增殖实验法检测样本的类雌激素活性水平。结果在枯水期和丰水期，饮用水源均发现了不同程度的类雌激素活性；枯水期雌激素活性超过丰水期。结论饮用水源已经受到了比较明显的有机污染物的污染，并具雌激素活性；改良饮用水源周边环境，控制水源周边环境工业废水、生活污水及农业污水的排放，迫在眉睫。     

载体介导的人支气管上皮细胞DNA聚合酶β基因的靶向RNA干扰

目的运用载体介导的RNA干扰技术靶向抑制人DNA聚合酶β基因在支气管上皮细胞中的表达,为研究DNA聚合酶β在环境化学污染物所致DNA损伤修复中的功能和机制作准备。方法利用分子克隆技术构建含pU6启动子的人DNA聚合酶β基因RNA干扰特异性绿色荧光蛋白C1载体重组子“pEGFP-C1-U6-dsRNA”;以脂质体法将载体重组子转染人支气管上皮细胞,同时以空白细胞和空载体转染细胞作对照;在经G418筛选后,以荧光显微成像技术观察细胞的转染效果,以蛋白印迹法分析转染后细胞中的DNA聚合酶β表达情况。结果在转染重组子的细胞中,DNA聚合酶β的表达明显下调,仅相当于正常细胞的17·3%。结论人支气管上皮细胞DNA聚合酶β基因的靶向抑制成功。     

妇康喷雾剂的毒理学评价

妇康喷雾剂的毒理学评价王家骤，佘素贞，徐德祥，孙美芳，魏凌珍，纪卫东，高步刚妇康喷雾剂具有温肾壮阳、疏通经络、固敛收摄、解毒止痒功效，主治女性性冷淡、阴冷症及阴痒带下。为保障临床使用者的安全，对其进行了毒理学系列研究。１材料与方法妇康喷雾剂由蛇床子、...