二羟环氧苯并芘诱发细胞恶变后基因和蛋白表达差异分析

目的 研究苯并（a）芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘（反式-BPDE）诱发人支气管上皮细胞系（16HBE）恶性转化的基因和蛋白表达的改变，探讨苯并（a）芘致癌的分子机制。     

硫化镍对16HBE细胞中基因的影响

目的 检测结晶型硫化镍(NiS)对K-ras基因和P15基因的改变及基因组不稳定性的影响，从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。方法 采用限制性片段长度多态性分析和聚合酶链反应一单链构象多态性分析方法探查结晶型NiS在诱导16人气管上皮细胞(HBE)恶变过程中的K-ras基因Exonl第12密码子及第12密码子以外的密码子改变情况。采用PCR-SSCP分析方法探查结晶型NiS在诱导16HBE细胞恶变过程中的P15基因Exon2存在状况。采用随机扩增多态性技术来对结晶型NiS在诱导16HBE细胞恶变过程中的基因组不稳定性进行分析。结果 K-ras基因Exonl和P15基因Exon2未发生改变。本实验所选用的7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带。其中P4、P5、P7两条引物扩增的片段在实验组和对照组之间无差异，其余4条引物均有差异。对于同一随机引物他们都具有特异的带型。结论 P15基因第2外显子和K-ras基因第1外显子(包括第12、13密码子)可能不是结晶型NiS作用的靶部位。在结晶型NiS诱发细胞恶性转化过程中，基因组变得逐渐不稳定。     

硫化镍与苯并芘转化人支气管上皮细胞基因差异表达谱的研究

目的用cDNA微阵列技术探讨经硫化镍(NiS)与二羟环氧苯并芘(dihydroxyepoxy benzo pyrene,BPDE)转化后的人支气管上皮细胞(16HBE)基因的差异表达;以了解不同种类和性质的化合物在转化细胞及致癌分子机制方面的异同;为预防人类生存环境不同外来化合物对人类健康的危害和影响提供科学依据.方法取16HBE分为NiS处理组,BPDE处理组和16HBE(对照组)三组同步培养,传代至第35代;提取三种细胞的总RNA,逆转录合成cDNA并以Cy3-dCTP和Cy5-dCTP荧光素分别标记制作探针.探针混合后与含4000个人类基因的芯片杂交.以ScanArray 4000扫描仪扫描芯片,以GenPix Pro3.0软件分析荧光信号,对三组差异表达的基因进行生物学信息分析.结果 NiS转化的16HBE细胞与BPDE转化的16HBE细胞经分析比较,呈现差异表达的基因有22个,其中11个(50%)下调,另11个(50%)上调.结论 NiS与BPDE对16HBE细胞株的转化作用在抑癌基因,细胞周期蛋白相关基因,细胞凋亡和应激反应基因相关基因,DNA合成、修复和重组蛋白相关基因,DNA结合、转录和转录因子类基因,细胞受体相关基因,代谢相关基因,蛋白翻译和合成相关基因等多类基因上呈现差异表达.认为基因芯片技术在筛选不同种类和性质的化合物转化细胞相关基因的改变上,具有高通量、高敏感、快速等特点,对化合物在细胞、分子毒作用和致癌机制的研究中意义重大.     

大气环境总悬浮颗粒污染物有机成份的毒作用研究

目的 了解佛山市城区大气环境总悬浮颗粒(TSP)污染物有机成份(EOM)的毒性作用.方法 运用大流量自动采样器.在呼吸带(1.2-2.0m)高度1.5m处,对佛山市城西工业区、旧城区及城南高新技术开发区的大气环境TSP污染物分别进行采样;运用二氯甲烷法(DCM法)抽提TSP污染物中的EOM成份(以DMSO定容);三个区的EOM样本均以3种不同浓度(5μ/ml、10μl/ml、20μl/ml)对人体支气管上皮细胞(16HBE)进行毒理学攻击实验;运用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测16HBE细胞DNA损伤程度.结果 城西工业区3种不同浓度的EOM均可引起16HBE细胞的DNA损伤效应.其它两区EOM样本的DNA损伤效应不明显.结论 EOM是城西工业区大气TSP污染物的重要毒性成份.     

细胞衰老过程中用6表观遗传学修饰研究

目的检测体外培养的人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程及细胞早衰阶段中P16的表观遗传学调控作用。方法在细胞复制性衰老过程（同步培养的22PDL正常人胚肺成纤维细胞于约50％融合度时进行400Ixmol／LH2O2处理，每天用H2O2染毒工作液染毒1次，每次2h，持续4d）中，将正常人胚肺成纤维细胞分为年轻细胞组（22PDL）、中年细胞组（35PDL）、复制性衰老细胞组（49PDL）；将经400umol／LH2O2染毒4d的22PDL人胚肺成纤维细胞继续培养7d，设为早衰细胞组。荧光定量PCR检测P16的mRNA表达水平，甲基化特异PCR检测其启动子区-846- —639bp的甲基化水平，染色质免疫沉淀结合定量PCR检测其相应启动子区组蛋白修饰情况，包括组蛋白H3、H4乙酰化和H3（Lys4）及H4（Lys20）甲基化修饰。结果与年轻细胞组相比，中年细胞组P，6的mRNA表达降低，复制性衰老细胞组和早衰细胞组P16的mRNA表达升高，差异均有统计学意义（P〈0．05）。在用6启动子区，第一外显子上游-1000bp内，其CpG岛片段长度为995bp，甲基化特异性PCR（MSP）扩增片段位于CpG岛内-846-639bp之间，长度为208bp。中年细胞组、复制性衰老细胞组、早衰细胞组甲基化引物扩增产物的相对含量分别为0．42、0．34、0．47，未甲基化引物扩增产物的相对含量分别为0．61、0．96、0．79。在P16IP1启动子区（-685—489bp），复制性衰老细胞组及早衰细胞组以组蛋白H4（Lys20）甲基化修饰为主；在川6IP2启动子区（-229- -60bp），复制性衰老细胞组受组蛋白H3、H4乙酰化和H4（Lys20）甲基化联合修饰。早衰细胞组以H3、H4乙酰化修饰为主。结论细胞衰老过程中，用6启动子区的组蛋白修饰联合调控其mRNA表达，复制性衰老与早衰的调控机制存在差异。     

慢病毒介导的RNA干扰技术建立hPARP-1缺陷细胞株

聚ADP核糖聚合酶(poly-ADP ribose polymerase,PARP)是真核细胞生物体内一类重要的DNA损伤修复酶家族.其在各种生物效应引起的DNA断裂的活化下,产生聚(ADP-核糖)合成活性与聚(ADP-核糖)转移活性,将ADP核糖单位转移至某些氨基酸残基上,对蛋白质进行修饰,继而产生各种不同的生物学效应[1].     

反式二氢二醇环氧苯并芘诱发细胞P53基因的变化

目的　观察苯并(a)芘[B(a)P]代谢产物反式二氢二醇环氧苯并芘[anti 7,8, dihydrodiol 9,10 epoxidebenzo(a)pyrene ,BPDE]诱发的恶性转化的人支气管上皮细胞(humanbronchialepithelialcells ,HBE)及其裸鼠成瘤细胞中的p5 3基因突变情况,探讨BPDE诱导细胞癌变的机制。方法　多聚酶链聚合反应 单链构象多态性分析(PCR SSCP)、基因测序。结果　PCR SSCP分析结果提示,反式BPDE诱发的恶性转化细胞及其裸鼠成瘤细胞p5 3基因的Exon 7和Exon 8有突变。基因测序发现裸鼠成瘤细胞(B3 )的p5 3基因Exon 8的第2 82位密码子位置出现了一个G→T点突变,其编码的氨基酸由精氨酸(CGG)→亮氨酸(CTG)。结论　反式BPDE可诱导p5 3基因发生突变,提示p5 3基因突变可能是BPDE诱导细胞癌变的重要机制之一。     

反式BPDE诱发人支气管上皮细胞系P53基因突变

目的　检测苯并 (ａ)芘的代谢产物反式 ＢＰＤＥ诱发的人支气管上皮细胞系Ｐ5 3基因突变 ,探讨苯并 (ａ)芘在人肺癌发生中的作用。方法　用反式 ＢＰＤＥ处理人支气管上皮细胞系 (16ＨＢＥ) ,银染ＰＣＲ ＳＳＣＰ方法检测Ｐ5 3抑癌基因第 5、6、7、8外显子的点突变情况。结果　 2 0ｄ后 ,经反式 ＢＰＤＥ处理的人支气管上皮细胞系与对照组相比 ,Ｐ5 3基因第 8外显子出现异常泳动带。结论　反式 ＢＰＤＥ可诱发人支气管上皮细胞系Ｐ5 3基因突变 ,可能是苯并 (ａ)芘诱发肺癌的早期分子事件反式BPDE诱发人支气管上皮细胞系P53基因突变@纪…     

三氯乙酸染毒对肝L-02细胞的增殖作用及对DNA甲基化水平的影响

目的 检测三氯乙烯(TCE)主要代谢产物三氯乙酸(TCA)对人肝L-02细胞染毒24 h后的增殖作用,以及对DNA总体甲基化水平的影响,探索TCE对肝L-02细胞的表型遗传毒性.方法 选择0.1-0.9 mmol/L浓度TCA作为合适的染毒剂量对肝L-02细胞染毒24 h后分别进行下列试验:以CCK-8试剂盒观测细胞的生长曲线;以抗5-mC抗体进行免疫荧光检测细胞核中胞嘧啶甲基化总体水平(代A 0.9 mmol/L染毒24 h);以流式细胞仪(FCM)检测其对细胞周期的影响及凋亡情况;提取细胞DNA进行琼脂糖电泳分析其对DNA的损伤作用.以上试验必要时设置5-氮杂胞苷(5-aza-dC5 μmol/L)处理的L-02细胞为基因组DNA低甲基化的对照以及肝癌细胞作为细胞周期分析的对照.结果 TCE在0.1～0.9 mmol/L浓度下染毒24 h后可以促进肝L-02细胞生长,并在0.9 mmol/L浓度作用下24 h可致肝L-02细胞DNA总体甲基化水平降低,荧光强度和正常细胞比较明显减弱;细胞周期分析发现TCA处理24 h后再用正常培养基继续培养24 h后可使细胞S G2期中细胞比例增加(与肝癌细胞接近);DNA梯状电泳分析未发现DNA损伤性改变.结论 TCA染毒24 h可促进细胞生长,可诱导基因组DNA低甲基化,并造成细胞周期的改变.提示TCA对肝细胞的早期细胞毒性作用与表型遗传机制有关.