D2-43病毒E蛋白在酵母细胞表面的展示

目的：在酵母细胞表面展示登革2型病毒43株(D2—43)的E基因，探索利用酵母表面展示系统建立DNA改组筛选平台的可行性。方法：通过RT-PCR扩增获得D2-43的E基因，将该基因亚克隆至T载体后，再克隆至酵母表面展示载体pYDI，于酿酒酵母EBY100中利用半乳糖进行诱导表达。表达产物采用间接免疫荧光法和FACS进行检测。结果：酵母表面展示产物可与D2-43的腹水抗体特异性地结合；在半乳糖诱导后24h，展示E蛋白的酵母细胞百分数达22．07％。结论：本研究为建立基于酵母表面展示系统的DNA改组筛选平台奠定了基础。     

登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1。进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价。结果成功构建了高效表达登革1型病毒NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价1∶1000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体。结论原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础。     

西尼罗病毒一步实时RT-PCR检测准确度评价

目的了解已建立的一步实时RT-PCR对西尼罗病毒感染细胞和组织的灵敏度及其对国内常见的黄病毒属病毒的特异性,为西尼罗病毒感染的实验室检测和流行病学调查奠定基础。方法使用VectorNTISuite8软件比较探针与西尼罗病毒不同系毒株之间的同源性。采用西尼罗病毒感染的Vero细胞培养上清和BALB/c小鼠脑组织样本评价一步实时RT-PCR法的灵敏度,同时用国内常见的黄病毒属病毒评价其特异性。结果此一步实时RT-PCR法可用于西尼罗病毒1系多数毒株的检测,灵敏度高,对西尼罗病毒的最低检出浓度为5.75×10-2pfu/ml;与黄病毒属乙型脑炎、登革热、蜱传脑炎以及甲病毒属东部马脑炎等虫媒病毒均未出现交叉反应。结论西尼罗病毒一步实时RT-PCR法具有灵敏度高、特异性强的特点,适用于西尼罗病毒感染细胞和组织的早期检测及流行病学调查。     

甲型H1N1流感流行的特点及分子基础

甲型H1N1流感病毒早期也曾被称为猪流感或猪源流感病毒,是此次暴发于墨西哥和美国的流感大流行的病原体.早在2009年3月18日,墨西哥的流行病监测网络在墨西哥联邦区就发现了流感流行.     

维甲酸诱导基因Ⅰ信号通路在西尼罗病毒感染中的作用研究

目的 探讨维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)信号通路在西尼罗病毒感染过程中的作用.方法 用西尼罗病毒Chin-01株感染A549细胞,分别通过RT-PCR和Western blotting检测病毒感染对RIG-Ⅰ及干扰素β(IFN-β)启动子刺激因子-1(IPS-1)表达的影响,通过含CAT报告基因的重组质粒观察病毒感染对干扰素调控因子-3(IRF-3)和IFN-β启动子活性的影响,并用ELISA法检测IFN-β的表达水平,明确西尼罗病毒感染对RIG-Ⅰ信号通路下游信号分子的激活作用.通过瞬时转染法在A549细胞中过表达RIG-Ⅰ,观察其对西尼罗病毒感染的影响.结果 西尼罗病毒感染能够上调RIG-Ⅰ的表达,激活IPS-1、IRF-3等下游信号分子,诱导Ⅰ型IFN的产生.同时,RIG-Ⅰ的过表达能够抑制西尼罗病毒的增殖.结论 RIG-Ⅰ信号通路介导的固有免疫反应可能在西尼罗病毒感染过程中发挥重要作用.     

狂犬病毒载体的构建与鉴定

目的构建狂犬病毒载体,为新型疫苗研究提供依据。方法将狂犬病毒减毒株SAE基因组分段扩增,然后经逐步拼接得到全基因组克隆,并在其中引入转录终止-起始元件和多克隆位点获得重组质粒pSAETOPO。将绿色荧光蛋白(EGFP)基因和西尼罗病毒prME基因分别克隆至pSAETOPO,然后将带有这两个基因的狂犬病毒全长cDNA切下并克隆至pcDNA3.1(+)载体。将获得的重组质粒pcSAE-GFP和pcSAE-ME转染细胞,分别观察辅助病毒对外源基因表达的影响。结果获得狂犬病毒载体质粒pcSAE-GFP和pcSAE-ME,经酶切分析和序列测定表明所构建克隆是正确的。pcSAE-GFP及pcSAE-ME转染细胞后,在辅助病毒存在下可表达相应外源基因。结论构建的狂犬病毒载体质粒可表达外源基因,为进一步获得表达外源基因的重组狂犬病毒奠定了基础。     

登革病毒抗体依赖性感染增强作用的研究进展

抗体依赖性感染增强作用(antibody-dependent enhancement,ADE)在登革病毒的致病机制中发挥重要作用.在存在亚中和浓度抗体的条件下,登革病毒可通过Fc受体或补体受体等途径进入靶细胞,进而导致ADE的发生.ADE的发生受病毒和宿主一系列复杂因素的调节,直接影响患者的临床表现和病情进展,对其作用机制的研究有助于加深对登革出血热发病机制的认识,对登革热疫苗以及治疗性抗体的研发具有重要意义.本文综述了登革病毒ADE的研究进展.     

EV71病毒感染动物模型研究进展

手足口病(hand-foot-and-mouth disease,HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病,肠道病毒71型(EV71)是其主要病原体[1-2].EV71病毒属于小RNA病毒科、肠道病毒属病毒,为单股正链RNA病毒[3-4].自1974年首次报道从美国加州神经系统疾病患者标本中分离到EV71以来,EV71病毒曾在世界范围内多次引起暴发疫情,主要引起婴幼儿手足口病和无菌性脑膜炎、脑炎等多种严重的神经系统疾病[5].近年来该病在国内流行,并出现重症和死亡病例[6].虽然其致病机制目前尚不十分清楚[7],临床上尚无高效的预防EV71病毒感染的疫苗或药物,部分灭活疫苗、病毒样颗粒疫苗、DNA疫苗等都在研制开发中[8].而合适的动物模型则是评价疫苗免疫及保护效果的重要平台.本文对EV71研究所用动物模型的建立、特点、研究应用等方面进行了综述.