Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建、筛选与初步鉴定

目的:构建针对B细胞淋巴瘤Daudi细胞系噬菌体抗体库,从中筛选特异性抗体,并对所筛选出的阳性克隆进行鉴定.方法:以Daudi细胞免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗血清滴度后,分离抗体阳性的小鼠脾淋巴细胞,提取RNA.利用RT-PCR扩增抗体к轻链和重链Fd片段,经Sac Ⅰ/Xba Ⅰ和Xho Ⅰ/Spe Ⅰ双酶切,依次克降入噬菌体载体pComb3H-SS的相应酶切位点,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建B细胞淋巴瘤Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库.以Daudi细胞为抗原对抗体库进行6轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过ELISA法对随机挑选的克降进行抗原结合活性测定,获得的阳性克隆进一步做DNA序列测定、在大肠杆菌XL1-Blue中进行可溶性表达,并用Western blot对表达产物的特异性作了鉴定.结果:构建了容量为3.13 × 107的抗人B细胞淋巴瘤Daudi细胞系的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了与Daudi细胞系特异性识别结合的4株阳性克隆.氨基酸序列分析结果显示:阳性克隆的重链、轻链可变区序列分别与基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链、轻链可变区序列有80%～94%和88%～95%同源性.阳性克隆成功在大肠杆菌细胞中可溶性表达,Western blot结果表明所获得的可溶性表达产物可与Daudi细胞膜抗原特异性结合.结论:成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Daudi细胞系膜抗原的抗体,为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫治疗提供了实验基础.     

PCR-SSP法和基因测序检测人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因第12位密码子点突变及其方式

目的检测人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因点突变及其突变方式，明确基因治疗靶点的碱基序列。方法针对K—ras基因第12位密码子点突变方式（CGT、GTT、GAT）设计顺序特异性引物（SSP），对人胰腺癌细胞株Patu 8988进行聚合酶链反应（PCR），扩增产物经12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后判断该细胞株有无K-ras基因点突变及其突变方式。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增人胰腺癌细胞株Patu 8988 K—ras基因，扩增产物直接进行基因序列测定。结果PCR—SSP法检测人胰腺癌细胞株Patu 8988存在K—ras基因点突变，突变方式为GGT→GTT，其结果与基因序列测定完全相符。结论明确了人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因第12位密码子点突变方式（GGP→GTT），为胰腺癌的下一步基因治疗研究打下了坚实的基础；PCR—SSP方法检测K-ras基因点突变简便、快速、经济且特异性高，有望在临床上成为早期诊断和鉴别诊断胰腺癌的实用检测方法。     

骨髓增生异常综合征8三体频率的间期荧光原位杂交研究

目的应用间期荧光原位杂交(FISH)技术检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者8号染色体三体(8三体)的发生率.方法采用荧光素SpectrumRed直接标记8号染色体着丝粒DNA探针,对66例MDS患者(病例具有连续性)和10例正常人的骨髓细胞进行间期FISH检测,并与常规细胞遗传学(CC)结果相比较.结果66例MDS患者中,间期FISH检测23例(34.8%)为阳性,而CC检测只发现其中15例为阳性.结论间期FISH在检测MDS患者8三体方面十分有用,是CC的一个重要补充.     

抗人B细胞淋巴瘤噬菌体单链抗体库的构建

目的构建抗人B细胞淋巴瘤单链抗体(ScFv)库。方法从人B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞免疫的BALB/c小鼠脾细胞中提取mRNA,RT-PCR扩增重、轻链可变区基因片断,连接成ScFv基因并扩增,将其克隆到噬菌体载体pHEN1中,构建成单链噬菌体抗体库。结果抗体库容量为3.4×106,约100%的噬菌体基因中有ScFv基因的插入。结论成功构建了抗人B细胞淋巴瘤噬菌体单链抗体库,方便进一步筛选抗人B细胞淋巴瘤抗体。     

血清N端脑利钠肽前体对老年人呼吸困难的鉴别诊断及疗效评估价值

目的 探讨血清N端脑利钠肽前体(NT-proBNP)水平对老年人呼吸困难的鉴别诊断及疗效评估价值.方法 采用电化学发光法测定72例65岁以上心源性呼吸困难、54例非心源性呼吸困难患者血清NT-proBNP水平,25例经治疗后复查;心超测量左心室射血分数(LVEF).同期20名健康体检老年人作为对照组.结果 心源性呼吸困难组LVEF显著降低,而NT-proBNP中位数显著高于其他组(均P＜0.01),非心源性呼吸困难组NT-proBNP中位数亦高于对照组;NT-proBNP与LVEF成负相关(r=-0.548,P＜0.05);诊断试验评价结果示ROC曲线下面积为0.932,以1 500 ps/ml为临界值,诊断老年人心源性呼吸困难的阳性预测值为84.0%,阴性预测值为91.1%,准确度为86.5%.治疗有效的21例患者NT-proBNP显著下降(P＜0.01).结论 血清NT-proBNP测定在心衰的诊断和预后评估及呼吸困难的鉴别诊断中具有重要价值.对于老年患者,应适当提高诊断临界值.

Abstract：

Objective To study the differential diagnostic value and prognosis estimation of serum N-terminal pro-brain natriuretic peptide(NT-proBNP) level in the elderly patients with acute dyspnea.Methods Serum level of NT-proBNP were measured with automated electrochemiluminescence immunoassay in 72 dyspneic patients with heart failure(HF) and 54 without HF who were elder than 65 years.Itwas measured again in 25 patients after therapy.Left ventricular ejection fraction(LVEF) was measured with heart ultrasonic in the same time.Twenty healthy cases were selected as the control group.Results LVEF of the group with HF was lower than those in the control group(P<0.01) ,while both median NT-proBNP in the two groups were considerably higher than those in the control group(P<0.01) ,and levels of NT-proBNP were negatively correlated with LVEF(r=-0.548,P<0.05).An optimal strategy to identify dyspneic patients with HF was used for ROC curve analysis(area=0.932) ,which yielded 84%positive predictive value.91.1%negative predictive value and 86.5%accuracy for dyspneic patients with HF at 1 500 pg/ml cut-off.NT-proBNP levels in 21 patients who had good prognosis decreased significantly.Conclusion NT-proBNP level is valuable for diagnostic evaluation and short-term prognosis estimation in dyspnoeic patients with suspected or confirmed HF.It is important to establish broader standards of the NT.proBNP in elderly dyspnoeic patients.     

bcl-2 RNAi表达载体的构建、鉴定及其对Raji细胞的干扰效果

目的 构建bcl-2特异性RNAi真核细胞质粒表达载体,并研究其对B细胞淋巴瘤Raji细胞的干扰效果.方法 根据GenBank提供的bcl-2 cDNA序列,设计并合成两对短发夹结构的互补DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至载体pGenensil-1构建重组质粒,予以酶切和DNA测序鉴定.脂质体介导重组质粒转染Raji细胞,采用RT-PCR法观察重组质粒对bcl-2 mRNA表达的影响,流式细胞仪测定细胞凋亡.结果 酶切及测序鉴定表明,成功构建bcl-2 shRNA的质粒表达载体pGenesil-1-bcl-2-544和pGenesil-1-bci-2-1009.转染Raji细胞48 h后,RT-PCR结果显示Raji细胞中bcl-2 mRNA表达分别下调了(31.95±3.02)%和(47.57±2.88)%,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示Raji细胞凋亡率分别为(14.25±0.84)%和(11.96±0.79)%,明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建bcl-2特异性RNAi真核细胞质粒表达载体,它能有效沉默bcl-2基因在B细胞淋巴瘤中的表达并促进B细胞淋巴瘤Raji细胞凋亡.     

~（125）I-脱氧尿嘧啶核苷对肺癌细胞A549的杀伤作用

目的探讨125I-脱氧尿嘧啶核苷（125I-UdR）对体外培养的A549肺癌细胞的杀伤作用及其影响因素。方法测定A549肺癌细胞在含有不同浓度125I-UdR的RPMI 1640培养液中培养48 h后细胞及细胞核摄取125I-UdR的量;测定肺癌细胞A549及脐静脉内皮细胞（ECV304）在含有100 kBq/ml 125I-UdR的RPMI 1640培养液中培养2～48 h后不同时间细胞摄取125 I-UdR的量;用细胞克隆形成法评价不同浓度125 I-UdR对A549肺癌细胞的杀伤作用。结果 A549细胞和细胞核摄取125I-UdR的量随培养基中125I-UdR浓度增加而增加;在含有100 kBq/ml浓度125 I-UdR的培养液中,随培养时间的延长A549细胞和细胞核摄取125 I-UdR的量增加。在不同培养时间下,A549细胞摄取125I-UdR的量在各时间点均明显高于ECV304细胞的摄取量。细胞存活分数随培养基中125I-UdR浓度增加呈递减趋势。结论 125I-UdR能够被A549肺癌细胞摄取,并快速进入细胞核内,且摄取量存在浓度依赖性和时间依赖性1,25I-UdR对肺癌细胞具有明显的杀伤作用。     

Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建、筛选及鉴定

本研究以人B细胞淋巴瘤Daudi细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞RNA出发，用基因克隆技术将B细胞全套k轻链和重链Fd片段基因克隆出来，组装到表达载体pComb3H—SS内并表达到噬菌体表面，构建出Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Daudi细胞为抗原对抗体库筛选后，获得针对B细胞淋巴瘤Daudi细胞系膜抗原的抗体。     

125I-UdR在胰腺癌荷瘤鼠治疗中的应用

目的研究125^I-UdR在胰腺癌裸鼠模型中的分布、治疗效果和用药安全性。方法胰腺癌裸鼠模型瘤内注射125^I-UdR，通过SPECT显像和测量各脏器放射性活度来观察125^I-UdR的药物分布规律；观察用药后瘤体外观和组织细胞的变化并作生存分析：分析用药后外周血象、肝肾功能等指标及骨髓象的表现来评价125^I-UdR的安全性。结果125^I-UdR局部注射后可在瘤内持续浓聚并致肿瘤细胞坏死；接受治疗的荷瘤鼠生存期明显延长；其外周血象和肝肾功能无明显变化，但骨髓象显示一过性的增生抑制。结论125^I-UdR可在肿瘤内持续浓聚并使肿瘤细胞坏死，有效延长生存期，但伴有一过性的骨髓增生抑制。     

8号染色体四体型恶性血液病患者的细胞遗传学和荧光原位杂交研究

尽管 8号染色体三体型 (三体 8)是最常见的常染色体数目异常 ,8号染色体四体型 (四体 8)却非常少见 ,且多伴其他染色体异常 ,单纯四体 8迄今文献仅报道 2 9例[1 ,2 ] 。初步研究表明四体 8异常可见于多种恶性血液病 ,且有某些共同的临床和预后特点 ,构成一种新的临床 细胞遗传学实体。间期荧光原位杂交 (Ｉ ＦＩＳＨ)研究发现四体 8患者几乎均同时存在三体 8克隆。我们近年来先后共发现 5例四体 8患者 ,对他们进行了ＦＩＳＨ研究 ,现报道如下。一、资料与方法1 .对象 :5例四体 8患者的资料 ,见表 1。2 .方法 :(1 )染色体检查 :染色体标本…