炭疽芽孢杆菌致病机制与疫苗研制策略研究进展

炭疽杆菌致病过程包括芽孢发芽、菌体繁殖和毒素分泌等多个环节。荚膜和毒素是公认的致病因子。毒素B亚单位（PA）可阻断ET、LT的致病作用，已用作疫苗，但繁殖体生长过程中产生的出血、蛋白溶解分子也是毒力分子。相应的抑制剂有治疗作用。现有炭疽粗制PA苗、芽孢苗安全有效，但仍存在不足。根据炭疽致病机制的研究进展，理想炭疽疫苗应同时靶向芽孢、荚膜和毒素及其他毒力因子等多个环节。     

布鲁杆菌基因工程疫苗免疫保护效率的初步观察

目的比较布鲁杆菌6种抗原表位所获得的基因工程疫苗的免疫保护效率。方法布鲁杆菌核糖体蛋白L7/L12、胞质蛋白P39、细胞表面蛋白BCSP31、二氧四氢喋啶合成酶BLS、16.5×103的外膜蛋白PAL和翻译起始因子IF3的基因片段与真核表达载体pcDNA3.1( )构建的核酸疫苗及上述6条片段转入pET32a( )后诱导表达的的重组蛋白免疫小鼠,3次免疫后进行攻毒实验,对其免疫保护效率进行初步观察。结果L7/L12和BLS的重组蛋白疫苗和核酸疫苗都产生了非常显著的保护作用,P39的核酸疫苗、IF3和BCSP31的重组蛋白疫苗也产生了非常显著的保护作用,其中L7/L12核酸疫苗的保护效率最高。结论初步认为布鲁杆菌的优势抗原表位所获得的基因工程疫苗可产生一定的抗布鲁杆菌作用,可作为未来布鲁杆菌新型疫苗的候选者,有进一步研究的价值。     

呼吸道合胞病毒的分离鉴定及其致病力的初步评价

目的分离鉴定临床呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV),评价其致病力,为疫苗评价及致病机制的研究提供实验材料。方法收集临床呼吸道感染重症患儿的鼻咽分泌物样本进行RT-PCR初步鉴定,通过病毒培养,空斑纯化,电镜观察及病毒滴度测定,筛选出1株呼吸道合胞病毒候选株,经全基因组测序后命名为BJ016。选用14日龄C57乳鼠,每组26只,采用BJ016为实验组,PBS为对照组,分别对小鼠滴鼻感染,30μl/只。连续14日监测2组小鼠体质量变化及死亡率,肺组织的病毒载量、湿干比,HE染色观察肺病理变化并计数炎性细胞总量,同时采用CBA测定血清中细胞因子的变化。结果 100份临床呼吸道感染重症患儿鼻咽分泌物样本中,RT-PCR鉴定为RSV A亚型阳性共21例,经病毒分离培养、空斑纯化、电镜观察及RT-PCR鉴定后得到16株RSV临床分离株,通过TCID50测定病毒滴度筛选出1株滴度为106.5TCID50/ml的候选株,基因组序列分析显示其为NA1基因型,命名为BJ016。BJ016感染14日龄C57乳鼠后造成肺损伤,在第5日达到发病高峰时测定病载、湿干比、病理检测并计数炎性细胞,实验组较对照组具有明显统计学差异,血清中MCP-1、IL-6、G-CSF及MIP-1α均显著性升高。结论成功分离出1株能致死14日龄C57乳鼠的RSV病毒株并初步评价了其致病力,为疫苗评价及RSV致病机制的研究提供了良好的实验材料。     

人用禽流感疫苗H5N1株三级毒种库的建立

目的:建立人用禽流感疫苗H5N1株三级毒种库,为生产疫苗提供毒种.方法:用SPF鸡胚培养病毒.对型别、滴度和无菌等各项检测合格后,建立人用禽流感疫苗H5N1株三级毒种库.结果:在33℃培养52 h条件下,毒种滴度为1:640～1:1 280;厌氧茵、细菌、真菌、支原体、血吸附病毒、非血吸附病毒和外源性禽白血病病毒检测均为阴性.将毒种在鸡胚上传至12代,滴度在1:320～1:640之间,中和抗体滴度在1:160以上,EID50在6.7以上;毒种HA、NA基因序列检测与公布的HA、NA基因序列的同源性达99.O%,代次之间达99.9%.结论:本工作为研制人用禽流感疫苗贮备了标准毒种.     

结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6融合基因DNA疫苗株的构建及免疫原性研究

目的构建结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA候选疫苗株并鉴定,初步评价其免疫原性。方法从GenBank中获取M. tuberculosis H37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列优化后合成,经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组,构建重组质粒PVAX1-Hsp65-Ag85B和PVAX1-Hsp65-ESAT6。重组质粒体外转染验证其表达后,免疫C57BL/6小鼠,检测特异性细胞免疫应答反应。结果 Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株在体内外均能表达,Western blot结果显示,DNA疫苗株体外转染293T细胞,24 h可检测到特异性蛋白条带,48 h蛋白表达量达最高。小鼠体内实验表明,Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均可激发较强的免疫反应,可诱导机体产生分泌高水平TNF-α的Th型免疫应答,且Hsp65-Ag85B优于Hsp65-ESAT6。结论 Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均具有较强的免疫原性,呈Th型细胞介导的免疫应答,推测Hsp65-Ag85B DNA疫苗的保护效力优于Hsp65-ESAT6,为新型结核DNA疫苗研制提供了实验依据。     

布氏杆菌PBP39蛋白抗原表达及免疫效果的研究

目的获得纯化的布氏杆菌PBP39重组蛋白抗原,观察PBP39重组蛋白的免疫原性.方法扩增不同种布氏杆菌PBP39基因,测序、连接表达载体PET32a,诱导表达,柱纯化PBP39重组蛋白抗原,免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗体及抗体亚型.结果我国牛、羊、猪布氏杆菌PBP39基因与国外已报道的PBP39编码基因不完全相同.在蛋白N端58位碱基后多一G,造成移码突变.故在85、86、87位编码终止子TCA.而在134、135、136位的ATG又编码了新的起始密码.布氏杆菌PBP39蛋白在大肠杆菌高效表达,表达量达40%,纯化重组蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,产生了较高水平的特异性抗体免疫应答,抗体亚型主要是IgG1.结论我国牛、羊、猪布氏杆菌PBP39编码抗原蛋白同国外已报道的不完全相同,纯化的PBP39重组蛋白抗原可诱导高水平的抗体反应,为筛选布氏杆菌病新型疫苗保护性抗原分子奠定了基础.     

DNA疫苗的免疫机制及其优化策略

DNA疫苗的研究成为疫苗研究领域的热点,被誉为疫苗研究的第三次革命,开创了人类与疾病作斗争的疫苗研究新篇章。DNA疫苗既可以诱导细胞免疫又可以诱导体液免疫应答,成为最有希望的新型疫苗之一,但其免疫机制还不是十分清楚,免疫原性相对较弱,限制了DNA疫苗的广泛应用。     

Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达、纯化及免疫效果评价

目的:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)进行表达,纯化后评价其免疫效果,以探索HSV-2重组亚单位疫苗的研制。方法:提取HSV-2DNA作为模板,用聚合酶链式反应(PCR)扩增gD2基因,克隆至pFastBac HTA载体中,利用载体中的His基因标记gD2,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达His-gD2融合蛋白,表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot检验,用镍柱进行纯化,免疫小鼠评价其免疫原性。结果:HSV-2gD2在昆虫细胞Sf9中得到特异性表达,纯化后的重组蛋白诱导小鼠体内产生高水平的IgG抗体及中和抗体。结论:gD2基因在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中获得表达,表达产物表现出良好的免疫原性及中和活性,为发展HSV-2亚单位疫苗奠定了基础。     

聚合酶链反应在布氏菌病诊断研究中的进展

近年来，国外学者运用ＰＣＲ技术成功地对布氏菌进行了特异性扩增。结果显示：ＰＣＲ对６种１９型布氏菌均扩增出特异性片段，而对十几种与布氏菌同源性高的革兰氏阴性菌没有特异性扩增片段，灵敏度为６０－１００ｆｇ，充分说明ＰＣＲ技术用于布氏菌病诊断具有重要的价值和应用前景。     

布氏菌减毒活菌苗的研究进展

布氏菌病（简称布病）是由布氏菌属细菌引起的世界范围内流行的人畜共患的传染一变态反应性疾病。主要表现为家畜流产不育以及人类波状热病，严重危害畜牧业发展和人类的生命健康。据世界统计资料表明，每年因布病造成的经济损失近30亿美元，我国单就新疆、青海两省（区）概算，每年因布病造成的直接经济损失约1亿元人民币。近年来布病在国内外都出现了再度肆虐的势头，引起国内外广泛关注。