淋巴滞留性脑病研究进展

到目前为止,中枢神经系统(central nervous system,CNS)还尚未发现存在衬有内皮细胞的真正意义上的淋巴管,但越来越多的研究证实脑淋巴引流途径存在,并且具有重要意义,已经引起国内外学者的广泛关注.     

大鼠边缘叶癫痫发作前后局部脑血流变化与脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达及神经元凋亡

目的：观察大鼠边缘叶癫痫发作前后局部脑血流变化，验证半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在癫痫大鼠脑海马CA3区神经元中表达与其神经元凋亡的关系。方法：实验于2002-05／2003-10在教育部重点实验室复日．大学华山医院神经病学研究所完成。选取清洁级SD雄性大鼠60只，随机分为5组：分组情况：①正常对照组6只，杏仁核内注射0.5μL磷酸缓冲液，其余4组均完成造模过程，杏仁核内注射红藻氨酸0．5μg溶于0．5μL的磷酸缓冲液中，pH值调至7．4。②单纯癫痫组36只，根据处死大鼠的时问点分为0，2，4，8，24，72h6组，6只／组，癫痫发作1h后经股静脉注射安定终止发作。③实验给药组6只，脑室内注射半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂z-DEVD-fmk。④实验对照组6只，脑室内注射磷酸缓冲液：⑤空白对照组6只，脑室和杏仁核内均注射磷酸缓冲液结果判定：①观察癫痫发作后双侧脑灌注率的变化，以癫痫发作前10mln的脑血流为基线，计算发作后占相应基线的百分率。②观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂对癫痫发作同侧脑海马CA3区TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)和存活神经元的影响。③观察癫痫发作同侧脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3细胞凋亡线粒体通路效应酶脑内的表达。结果：共60只大鼠进入结果分析。①单纯癫痫4h组癫痫发作前后局部脑血流无明显变化，双侧脑灌注率波动范围在10％以内。②脑室内注射半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂可减少TUNEL阳性细胞，增加存活的神经元。③正常对照组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在脑神经元内构成性表达主要分布于神经元细胞核周围；单纯癫痫组癫痫发作终止24h时同侧脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3弥散于部分神经元的整个细胞，即免疫反应性增强。结论：①癫痫大鼠发作时脑灌注率波动较小，局部腩血流无明显变化，说明其神经元凋亡与脑缺血无关。②给予半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂可明显减少大鼠癫痫侧脑海马CA3区神经元的凋亡，增加存活的神经元。提示半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在介导癫痫大鼠神经元的凋亡中发挥了作用。     

大鼠边缘叶癫痫发作前后局部脑血流变化与脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达及神经元凋亡

目的:观察大鼠边缘叶癫痫发作前后局部脑血流变化,验证半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在癫痫大鼠脑海马CA3区神经元中表达与其神经元凋亡的关系。方法:实验于2002-05/2003-10在教育部重点实验室复旦大学华山医院神经病学研究所完成。选取清洁级SD雄性大鼠60只,随机分为5组。分组情况:①正常对照组6只,杏仁核内注射0.5μL磷酸缓冲液,其余4组均完成造模过程,杏仁核内注射红藻氨酸0.5μg溶于0.5μL的磷酸缓冲液中,pH值调至7.4。②单纯癫痫组36只,根据处死大鼠的时间点分为0,2,4,8,24,72h6组,6只/组,癫痫发作1h后经股静脉注射安定终止发作。③实验给药组6只,脑室内注射半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂z-DEVD-fmk。④实验对照组6只,脑室内注射磷酸缓冲液。⑤空白对照组6只,脑室和杏仁核内均注射磷酸缓冲液。结果判定:①观察癫痫发作后双侧脑灌注率的变化,以癫痫发作前10min的脑血流为基线,计算发作后占相应基线的百分率。②观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抑制剂对癫痫发作同侧脑海马CA3区TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)和存活神经元的影响。③观察癫痫发作同侧脑海马CA3区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3细胞凋亡线粒体通路效应酶脑内的表达。结果:共60只大鼠进入结果分析。①单纯癫痫4h组癫痫发作前后局部脑血流无明显变化,双侧脑     

海马局部脑组织血流量和神经元特征性变化与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8介导癫痫大鼠的关系

目的：检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8在癫痫大鼠海马神经元的表达及其与癫痫发作大鼠局部脑血流量和神经元变化的关系。方法：实验于2002—05／2003-10在复旦大学神经病研究所完成。选择清洁级SD雄性大鼠60只，随机分为①正常对照组6只：杏仁核注射磷酸盐缓冲液。②空白对照组6只：磷酸盐缓冲液(脑室) 磷酸盐缓冲液(杏仁核内)。③单纯癫痫组36只：杏仁核内注射红藻氨酸诱发癫痫发作，发作1h后经股静脉注射安定(30mg／kg)终止发作，根据处死大鼠的时间点分0，2，4，8，24，72h6组，每组6只大鼠。⑧试验给药组6只：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8抑制剂z-IETD-fmk(脑室，0．3μg于红藻氨酸注射前20min，5min及红藻氨酸注射后1h分3次给药) 红藻氨酸(杏仁核内)。⑤实验对照组6只：磷酸盐缓冲液(脑室) 红藻氨酸(杏仁核内)；均于安定注射终止发作后24h处死大鼠。结果评估：①激光多普勒血流测定仪记录局部脑血流。②用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记染色和cresvl violet染色观察海马神经元凋亡和存活的变化及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8抑制剂z—IETD—fmk对海马CA3区的脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记阳性细胞和存活细胞的影响。③用免疫荧光和蛋白印迹检测海马半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8的表达。结果：造模过程中有2只大鼠死亡，补充2只，进入结果分析大鼠保持为60只。①红藻氨酸注射后10～20min内脑灌注率显示轻微升高趋势，随后于20～60min内逐渐下降，60min后脑灌注率基本保持稳定，发作前后脑灌注率无明显变化。②发作终止即刻半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8出现裂解片断，8h时出现脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记阳性细胞，24h时达高峰，存活神经元减少。脑室内注射半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8抑制剂z-IETD-fmk可减少脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记阳性细胞，增加存活神经元。③用免疫荧光和蛋白印迹检测结果：发作后在红藻氨酸注射同侧海马的CA3区神经元半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8免疫反应性增强。结论：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8的激活参与了癫痫发作诱导海马CA3区神经元的损伤，且与局部脑血流量变化无关.     

银杏叶提取物对蛛网膜下腔出血后氧自由基损伤的缓解效应

目的:观察银杏叶提取物对蛛网膜下腔出血后氧自由基代谢的影响及该影响是否存在剂量依赖性。方法:①实验于2003-05/12在泰山医学院脑微循环实验室和附属医院中心实验室完成。选用Wistar大鼠54只。将动物随机分为5组:对照组(6只)、模型组(12只)、溶媒组(12只)、银杏叶提取物100mg/kg组(12只)和银杏叶提取物200mg/kg组(12只)。②股动脉采血后经冻-溶制备自体动脉血溶血物并注入大鼠枕大池制作蛛网膜下腔出血模型(除对照组外其余4组均造模)。③对照组:用0.3mL生理盐水代替动脉血溶血物行脑池注射;模型组:蛛网膜下腔出血造模后不给予干预;溶媒组:腹腔注射等体积含tween80的生理盐水;银杏叶提取物100mg/kg和银杏叶提取物200mg/kg组:在脑池注入自体动脉血溶血物开始前30min分别按100mg/kg和200mg/kg(首次剂量)腹腔注射银杏叶提取物溶液(为棕黄色粉末,由上海绿源制药有限公司提供,含银杏苦内酯≥6%,银杏黄酮≥24%。银杏叶提取物溶液在临用前新鲜配制,在银杏叶提取物粉剂中加入适量tween80溶液,研磨后,加入生理盐水使之成3%和6%的溶液),以后每天以上述半量重复2次;以上干预至各标本获取点前12h为止。④于造模后24h和72h按照购于南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作测定各组大鼠脑组织匀浆中超氧化物歧化酶活力和丙二醛含量。⑤计量资料差异比较采用方差分析。结果:大鼠54只均进入结果分析。①脑组织超氧化物歧化酶活性:模型组和溶媒组于造模后24和72h明显低于对照组(P<0.01);银杏叶提取物100和200mg/kg组于造模后24和72h明显高于模型组(P<0.01);银杏叶提取物100与200mg/kg组间差异不明显。②脑组织丙二醛含量:模型组和溶媒组于造模后24和72h明显高于对照组(P<0.01);银杏叶提取物100和200mg/kg组于造模后24和72h明显低于模型组(P<0.05～0.01);银杏叶提取物100与200mg/kg组间差异不明显。结论:银杏叶提取物能够有效减轻蛛网膜下腔出血后氧自由基连锁反应所致脑损伤,且不存在明显剂量依赖性。     

蛋白激酶C在甲醛复制内脏炎症痛大鼠脊髓背角神经元电活动中的作用

目的:观察蛋白激酶C抑制剂氯丙嗪对甲醛复制的内脏炎症痛大鼠脊髓背角神经元电活动的影响,了解蛋白激酶C在甲醛复制的内脏炎症痛中的作用。方法:实验于2005-01/11在泰山医学院基础医学研究所完成。选用24只健康成年Wistar大鼠,数字表法随机分为3组(n=8):①甲醛组:体积分数为0.05的甲醛100μL直肠黏膜下注射致炎,复制内脏炎症痛模型。②甲醛 生理盐水组:在脊髓背角找到对直肠刺激敏感的神经元后,腹腔注射生理盐水0.4mL/kg,30min后记录前对照反应,然后行甲醛直肠黏膜下致炎,方法和剂量同甲醛组。③甲醛 氯丙嗪组:腹腔注射25g/L氯丙嗪0.4mL/kg,其余处理同甲醛 生理盐水组。记录3组大鼠注射甲醛后120min内脊髓背角神经元放电频率的变化,以15min为一个时间段,共记录8个时间段。以给药前神经元的放电频率为参照,计算给药后反应的相对值(给药后实际反应频率/给药前实际反应频率×100%)。结果:24只大鼠全部进入结果分析,共记录到24个单位的反应结果。①甲醛组在给药后0～15min和16～30min时间段的放电频率分别为致炎前基线水平的(283.7±46.0)%和(254.0±37.4)%,与致炎前相比均有显著性增加(P<0.05)。②甲醛 氯丙嗪组在致炎后0～15min和16～30min两时间段的脊髓背角神经元放电频率分别为基线水平的(124.6±10.25)%和(105.4±8.69)%;甲醛 生理盐水组致炎后同时间段的放电频率为基线水平的(279.7±37.4)%和(249.2±38.5)%。甲醛 氯丙嗪组在致炎后0～15min和16～30min两时间段的放电频率低于其他2组(P<0.05),另2组比较差异不显著(P>0.05)。结论:①甲醛直肠黏膜下注射可稳定复制大鼠炎症性内脏痛模型。②蛋白激酶C抑制剂氯丙嗪可使脊髓背角神经元放电频率减少,提示蛋白激酶C参与甲醛诱导急性炎症引起的痛觉敏感化的形成。     

小鼠PP1基因启动子克隆鉴定及潜在甲基化位点分析

目的 PP1分子是一种与学习记忆相关的分子,目前对其表达调控尚未有系统的研究。为了研究小鼠PP1基因启动子区甲基化潜在的位点和转录因子结合位点而克隆小鼠PP1启动子区。方法本实验利用NCBI上小鼠PP15’非翻译区序列设计引物,使用高保真Taq酶,利用PCR方法扩增昆明小鼠PP1启动子0至-320序列,并进行TA克隆,测序鉴定。利用亚硫酸氢钠处理基因组DNA,通过PCR技术和测序技术对PP1启动子0至-320序列甲基化情况分析。然后再应用Methyl Primer Express software V1.0和TFSEARCH软件分析该区域甲基化位点和转录因子结合位点。利用CpG岛序列分析软件分析。结果成功克隆得到PP1基因启动区0到-320 bp片段。甲基化测序分析该片段只有一个CpG位点被甲基化。软件分析表明小鼠PP1翻译起始点到-320 bp区域C+G含量高达70.25%,CpG含量为11.75%,含有70个潜在的转录因子结合位点。结论在小鼠PP1基因启动子区0～-320发现有一个CpG岛和多个转录因子结合位点,该区域可能在小鼠PP1基因表达调控起重要作用。     

蛋白激酶C抑制剂灯盏花素对低氧预适应小鼠海马NO/cGMP信号转导系统的影响

目的探讨NO/cGMP信号转导系统在低氧预适应中的作用及灯盏花素对其的影响。方法将B lb/c近交系小鼠随机分为空白对照组（H0组）、低氧对照组（H1组）、低氧预适应组（H4组）、药物对照组（C）和灯盏花素组（EB）。观察H1、H4、C和EB组小鼠低氧耐受时间；用分光光度计法测定各组小鼠海马NOS活性、NO产量和放射免疫法测定cGMP含量。结果（1）H4、C和EB组小鼠低氧耐受时间显著多于H1组，且EB组明显多于H4组，H4和C组没有显著差异。（2）H1、H4、C和EB组NOS活性、NO、cGMP含量均高于H0组，H4、C和EB组明显低于H1组，且EB组显著低于H4组，H4和C组没有明显差异。结论NO/cGMP信号转导系统在低氧预适应中起重要作用，灯盏花素通过抑制NO/cGMP信号转导系统参与低氧预适应的产生。     

大鼠福尔马林内脏炎症痛过程中脊髓PKCγ、PKCβⅡ膜转位的变化

目的 初步探讨PKCγ、PKCβⅡ在内脏炎症痛过程中的作用。方法 本实验用福尔马林复制的内脏炎症痛模型，经脊髓蛛网膜下腔插管给予PKCγ、PKCβⅡ激动剂PMA（phorbol 12-myristate 13-acetate）和抑制剂H-7（1-（5-isoquinolinesulfonyl）2-methylpiperazine dihydrochloride）。结合 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白印迹（Western-blot）等生化技术，选用成年健康Wistar大鼠，随机分4组：N；F＋IT＋NaCl；F＋IT＋PMA；F＋IT＋H-7。共分福尔马林直肠内致炎后30min、60min和120min三个时间段。结果 在福尔马林直肠致炎后30min内，F＋IT＋NaCl组与N组PKCγ膜转位相比明显增多（P〈0．01），F＋IT＋PMA组与F＋IT＋NaCl组相比明显减少（P〈0．05），F＋IT＋H-7组与F＋IT＋NaCl组相比明显增高（P〈0．05）；在福尔马林直肠致炎后的30min、60min和120min三个时间段内，PKCβⅡ膜转位没有明显变化（P〉0．05）。结论　福尔马林致内脏炎症痛过程中PKCγ被激活、PKCβⅡ没有被激活，提示PKCγ可能参与了内脏炎症痛的发生；PKCβⅡ可能没有参与内脏炎症痛的发生。     

偏头痛实验动物模型研究进展

偏头痛是原发性神经系统和非神经系统综合征,表现为单纯或双侧反复发作、搏动性中重度头痛,发作前可有一过性视物模糊、闪光、偏盲、偏侧肢体感觉及运动障碍、语言障碍等先兆症状,发作期常有恶心、呕吐、畏光、怕声等伴发症.偏头痛的人群发病率超过10％,目前临床上难以彻底治愈.世界卫生组织将严重偏头痛定为最致残的慢性疾病之一,其给患者和社会带来了沉重的精神和经济负担.偏头痛的发病机制尚无定论,目前较公认的理论解释为:遗传易感性所致的内源性痛觉调节系统抑制功能缺陷,在内外环境刺激下,皮质或三叉神经颈髓复合体(trigeminocer-vical complex,TCC)神经电活动异常,引起一系列神经、血管、递质改变,导致偏头痛[1].据此学说目前设计出了多种偏头痛动物模型.本文以诱导靶点为分类依据,将现有的偏头痛动物模型分类并将其原理、方法及特点综述如下.