错配PCR致突变的实验条件研究

目的：对目前常用的致突菌株和PCR随机突变方法进行评价。方法：用单链抗体表达质粒转化致突菌株XL1-Red，转种传代7d，选取克隆测定DNA序列。用错配PCR在相同基因中引入突变，比较不同Mg^2 浓度、不同dNTP的浓度、不同dITP等条件下所致突变率。结果：在XL1－Red菌株中转种7d（约50代）后，测定突变率＜0.1%。在错配PCR中，增加Mg^2 浓度可提高突变率，增加dTTP和dCTP浓度的致突变效果优于增加dATP和dGTP的效果。在dITP配以低浓度的dATP或dGTP时突变率较低，使用5mmol/L MgCl2、0.5mmol/L MnCl2、1mmol/L dTTP和dCTP的条件下，经2轮PCR（共60个循环）突变率可＞2％。其突变类型有明显偏向性，以A／T的突变为主，转移多于颠换。结论：用致突菌株引入的突变率过低，不适用于抗体亲和力成熟，错配PCR在合适条件下可达到2％以上突变率，适用于随机突变抗体库的构建，但其突变类型有偏向性，应予以考虑。     

替米沙坦对脂多糖诱导3T3-L1脂肪细胞炎症通路的影响

目的 研究替米沙坦对脂多糖诱导3T1-L1脂肪细胞炎症通路的影响,探讨替米沙坦的抗炎机制.方法将3T3-L1脂肪细胞诱导至90%成熟,按随机数字表法分为6组:对照组、LPS组、LPS+替米沙坦(0.01、0.1、1和10μg/ml)组(n=18),向对照组细胞中加DMSO,LPS+替米沙坦组细胞中加入不同浓度替米沙坦,孵育2h后,LPS组和LPS+替米沙坦组再加入脂多糖(1 μg/ml),孵育1h,Western免疫印记法比较各组核蛋白NF-κBp65、总蛋白p-IκBα、IκBα、p-ERK1/2、ERK1/2、P-p38MAPK、p38 MAPK的表达水平.结果 脂多糖刺激后IκBα磷酸化蛋白表达增强(P＜0.05),细胞核内NF-κBp65蛋白表达增多(P＜0.05),MAPK通路相关蛋白ERK1/2磷酸化和p38MAPK磷酸化水平明显增强(P＜0.05),替米沙坦可抑制IκBα磷酸化和NF-κBp65核转位,p-IκBα蛋白表达和核蛋白NF-κBp65表达均降低,大剂量替米沙坦(10 μg/ml)作用时该作用明显(P＜0.05).替米沙坦干预后,p-ERK1/2和p-p38MAPK蛋白表达也受到明显抑制(P＜0.05),大剂量(10μg/ml)时作用明显(P＜0.05).结论 在3T3-L1脂肪细胞中,替米沙坦可以抑制NF-κB通路中IκBα蛋白磷酸化、NF-κBp65蛋白核转位以及MAPK通路中ERK1/2蛋白和p38MAPK蛋白的磷酸化,从而发挥抗炎作用.     

促肾上腺皮质激素单克隆抗体的筛选和鉴定

目的制备促肾上腺皮质激素 ( ACTH)单克隆抗体 ,拟建立高灵敏度 ACTH- IRMA或 EL ISA。方法 ACTH1 - 1 3、ACTH1 - 2 8、ACTH 1 - 39和 ACTH1 8- 39分别与牛血清白蛋白偶联制备免疫原 ,在背部皮下和腹腔注射免疫 BAL B/ c鼠。按常规方法进行细胞融合 ,以 RIA法检测培养上清液 ,阳性孔经亚克隆 ,获得 2株分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株 ;瘤细胞种于预致敏的BAL B/ c鼠腹腔 ,批量生产单抗性腹水 ;琼脂扩散法鉴定抗体类型 ;利用标准曲线的参数计算单抗的亲合常数 ;亲合纯化单抗并进行抗体固化试验。结果从 ACTH1 - 2 8免疫鼠获得单抗株为 5 G2 ,从 ACTH1 - 1 3免疫鼠获得单抗株为 D3 ;单抗腹水 5 0 %结合率时腹水最终稀释度分别为 5× 10 3和 2× 10 3;抗体类型均为 Ig G1/λ;5 G2和 D3亲合常数分别为 5 .1× 10 9L M- 1 和 4 .9× 10 7L M- 1 ;抗体包被实验显示 5 G2和 D3的固化抗体量分别为 1.4μg和 8.8μg时结合率达到饱和。结论 5 G2和 D3可以用于构建灵敏的 ACTH- IRMA或 EL ISA。     

联合应用错配PCR和交替延伸PCR法提高抗TNFα抗体亲和力

目的：通过突变方法提高抗TNFα单链抗体pscTNF的亲和力。方法：以pscTNF质粒为模板，应用错配PCR构建突变抗体库，筛选亲和力得到改善的变种，再以所获变种为模板，用交替延伸PCR技术，再次构建突变库，筛选活性得到改良的克隆。以斑点ELISA方法及硫氰酸盐洗脱ELISA法评估其亲和力的改善。结果：从错配PCR抗体库中筛选得到7个活性有所增强的变种，再通过交替延伸PCR使这7个变种的突变位点交换重组，获得了亲和力进一步提高的克隆。结论：联合应用错配PCR和交替延伸PCR法可提高单链抗体亲和力。     

甲状腺激素对大鼠脾淋巴细胞内ACTH的影响

本实验通过药物诱发SD大鼠发生甲亢和甲低，研究甲状激素对脾淋巴细胞内免疫反应性ACTH（irACTH)的影响，甲亢组大鼠体重显著低于甲低组和对照组；血清TT3，FT3，TT4，FT4在甲亢组和甲低组间有显著差异；相同细胞数内irACTH量，甲亢组略高于对照组，而甲低组则显著低于另两组，表明甲状腺激素对淋巴细胞内irACTH的合成有正调节作用。     

重组甘精胰岛素注射液的人体药代动力学、药效学及生物等效性研究

目的 以低精蛋白重组人胰岛素注射液(诺和灵N)作为参比制剂,评价重组甘精胰岛素注射液国产制剂(长秀霖)和进口制剂(来得时)的生物等效性.方法 采用随机、单盲、单中心、交叉设计方法对16名健康男性志愿者进行长秀霖和来得时试验,其中6名接受诺和灵N试验.受试者皮下注射胰岛素(0.4 U/kg)后24h内,以葡萄糖钳夹技术维持受试者血糖在5.0 mmol/L左右.结果 与皮下注射诺和灵N相比,皮下注射长秀霖和来得时后,试验中葡萄糖输注率及血清胰岛素浓度在2～4h内迅速上升达到平台期,至注射后24h仍保持较平稳,无明显峰值.长秀霖和来得时组试验中葡萄糖输注率最大值(P<0.01)和血清胰岛素浓度最大值(P<0.05)均明显低于诺和灵N组.经交叉试验设计的多因素方差分析表明,皮下注射长秀霖和来得时组间主要药代动力学参数INS-AUC0～24h、INS-Cmax差异均无统计学意义(P>0. 05).Tmax经非参数检验法的秩和检验差异无统计学意义(P>0. 05).经双单侧t检验及90% CI计算,Ln(AUC0～24h)的90% CI(82.0%～105.2%)为80%～125%,Ln(Cmax)的90% CI(78.9%～107.7%)为70%～143%.结论 长秀霖和来得时均比诺和灵N具有更平稳的降糖效应和更平稳的血清胰岛素浓度,药效学和药代动力学参数统计分析结果表明长秀霖与来得时具有生物等效性.     

不同糖耐量人群血浆同型半胱氨酸水平与胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能的关系

目的：观察不同糖耐量阶段血浆同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）水平,探讨Hcy与胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能的关系。方法：选择在我院健康查体的83名符合入选标准的个体,行标准口服75g葡萄糖耐量试验,留取空腹血标本测定血脂、肝肾功能、Hcy等指标,留取空腹、服糖后2h血标本测定血糖和胰岛素水平、尿微量白蛋白/肌酐水平。Hcy采用免疫荧光偏振法测定。结果：经糖耐量试验将入选者分为糖耐量正常组（NGT）32例,糖耐量减低组（IGT）24例和新诊断糖尿病组（DM）27例。IGT组和DM组空腹Hcy水平明显高于NGT组（P〈0.01）。IGT组和DM组HOMA-IR显著高于NGT组（P〈0.01）,IGT组和DM组ISI显著低于NGT组（P〈0.01）,NGT组和IGT组HBCI显著高于DM组（P〈0.01,P〈0.01）,经HOMA-IR校正之后,NGT组HBCI/IR显著高于IGT组（P〈0.01）。IGT组FBCI显著高于NGT组和DM组（P〈0.05,P〈0.01）,经HOMA-IR校正之后,NGT组FBCI/IR显著高于IGT组和DM组（P〈0.05,P〈0.01）,IGT组FBCI显著高于DM组（P〈0.01）。相关分析显示Hcy与ISI（r=-0.335,P=0.030）呈显著负相关,经HOMA-IR校正后,Hcy与HBCI/IR和FBCI/IR呈显著负相关性。多元逐步回归分析显示,腰围、尿Alb/Cr、FINS、HOMA-IR、FBCI和FBCI/IR对Hcy有显著影响。结论：糖耐量受损者其血浆Hcy水平高于糖耐量正常者,胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损与糖耐量异常者血浆Hcy水平明显相关。     

同型半胱氨酸对胰岛β细胞胰岛素分泌及凋亡的影响

目的 探讨同型半胱氨酸(Hcy)对克隆的胰岛β细胞NIT-1细胞株胰岛素分泌、细胞生存率及细胞凋亡的影响.方法 将Hcy作用于NIT-1细胞后,用放射免疫分析法检测不同浓度Hcy作用不同时间后对细胞胰岛素分泌的影响;用溴化(4,5二甲基2噻唑基)2,5二苯基四氮唑分析法检测细胞生存率;流式细胞仪磷脂结合蛋白V/PI双染色法和琼脂糖凝胶电泳检测不同浓度的Hcy作用不同时间对NIT-1细胞凋亡的影响.结果 50 μmol/L的Hcy作用24 h以及100 μmol/L的Hcy作用12 h后,细胞胰岛素的分泌量较正常对照组分别下降了17.1%和10.8%,差异有统计学意义(均P＜0.01).100 μmol/L的Hcy作用12、24 h后细胞存活率分别降至95%、88%,与对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);50 μmol/L的Hcy作用48、72 h后,细胞存活率分别降至91%、87%,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).当100 μmol/L Hcy作用24 h,NIT-1细胞凋亡率为7.2%(P＜0.01);250 μmol/L的Hcy作用12 h,NIT-1细胞凋亡率为12.9%(P＜0.05).琼脂糖凝胶电泳显示随着Hcy浓度增加,凋亡NIT-1细胞的DNA电泳条带呈现为明显的梯形条带.结论 Hcy对胰岛β细胞胰岛素分泌的抑制作用呈时间、剂量依赖性.Hcy对细胞的生存率具有抑制作用,且以时间和浓度依赖性的方式诱导胰岛β细胞凋亡.     

饱和游离脂肪酸通过其代谢产物酰基辅酶A导致卵巢颗粒细胞凋亡

探讨脂肪酸对人卵巢颗粒细胞生长的影响。不同剂量的游离脂肪酸处理颗粒细胞1－3天，用台盼蓝排除法对活细胞进行计数。用染色体DNA断裂和细胞形态学改变确定细胞凋亡。检测脂肪酸代谢产物酰基辅酶A是否直接引起细胞凋亡。测定与细胞凋亡相关的Bcl－2和Bax蛋白质表达水平。结果表明，饱和脂肪酸通过其代谢产物酰基辅酶A呈剂量依赖性的引起颗粒细胞凋亡，并导致Bcl-2水平下降和Bax水平升高。说明饱和脂肪酸对卵巢颗粒细胞有直接致凋亡作用。提示，女性肥胖和胰岛素抵抗患者出现的性功能障碍可能与饱和脂肪酸水平增高有关。