上皮-间质转化在人结肠癌细胞系SW480对西妥昔单抗及氟尿嘧啶耐药中的作用

目的探讨人结肠癌细胞系SW480上皮-间质转化现象与其在化疗药物及靶向药物耐药中的作用.方法西妥昔单抗(cetuximab,C225)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)以及二者联合处理人结肠癌细胞系SW480,观察细胞形态,免疫荧光化学方法检测处理前后SW480细胞骨架改变以及E-钙粘素(E-cardherin)、波形蛋白(vinmentin)表达差异,Western blot方法检测实验组与对照组SW480细胞E-cardherin、Vinmentin以及多药耐药蛋白(MRP)、P-糖蛋白(P-gp)表达差异;体外药物敏感试验(cell Counting Kit-8,CCK-8比色法)分别检测实验组与对照组SW480细胞存活能力.结果 SW480细胞经C225、5-Fu以及二者联合处理后细胞形态由上皮细胞向间质细胞转化;细胞免疫荧光显示处理前后SW480细胞骨架改变,微丝蛋白排列极性增强,E-cardherin表达下降,Vinmentin表达升高,同时伴随MRP、P-gp表达增高.SW480细胞经C225与5-Fu联合处理较单独应用2个药物细胞存活率明显降低(P<0.05).结论 SW480细胞经单独使用靶向药物或化疗药物以及两者联合应用可诱导细胞发生EMT,且此EMT对肿瘤细胞耐药有影响.     

VEGF-C基因RNA干扰真核表达载体的构建及其效果鉴定

目的:构建VEGF-C基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体。方法:以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果:经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论:利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。     

mTOR信号通路调控HK-Ⅱ表达对结肠癌细胞增殖的影响

目的：探讨mTOR信号通路是否可通过调控HK—Ⅱ蛋白表达的途径来影响结肠癌细胞增殖。方法：Western印迹检测结肠癌细胞mTOR、HK—Ⅱ蛋白表达水平，并观察抑制mTOR信号通路对HK—Ⅱ蛋白表达的影响。采用MTT法检测mTOR和HK—Ⅱ特异性抑制剂作用后结肠癌细胞增殖的变化。结果：mTOR、HK—Ⅱ蛋白在4种结肠癌细胞中均明显表达；抑制mTOR可阻断结肠癌细胞HK—Ⅱ蛋白表达；抑制mTOR和抑制HK—Ⅱ均可明显控制结肠癌细胞增殖，且两者有协同效应。结论：mTOR信号通路可能通过调控HK—Ⅱ的表达影响结肠癌细胞增殖。     

Tiam1和Rac1在大肠癌组织中的表达及其临床意义

目的：观察人大肠癌和正常大肠黏膜组织中T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1，Tiam1）和RacGTP酶激活蛋白1（Rac GT Pase activating protein1，Rac1）的表达情况并探讨其临床意义。方法：应用SP免疫组化法检测50例经4％中性甲醛固定和石蜡包埋的大肠癌及50例正常大肠黏膜组织标本中Tiam1和Rac1蛋白的表达情况并分析其与大肠癌临床病理参数间的关系。结果：Tiam1和Rac1蛋白在正常大肠黏膜组织中均呈阴性染色（0／50，0），但在大肠癌组织中则呈阳性染色（42／50，84．00％），两者间差异有统计学意义，P=0．003。Tiam1和Rac1蛋白染色阳性率在高分化（9／13，69．23％）和低分化（14／14，100．00％）之间、T1＋T2或Ⅰ＋Ⅱ期（8／13，61．54％）和T3＋T4或Ⅲ＋Ⅳ期（34／37，91．89％）之间、无淋巴结转移（15／22，68．18％）和有淋巴结转移（27／28，96．43％）之间的差异均有统计学意义（P值分别为0．025，0．01，0．007），但Tiam1和Rac1蛋白表达水平与大肠癌患者的性别、年龄、癌变原发部位及癌肿大小无关（P值分别为0．686，0．975，0．791，0．709），差异无统计学意义。结论：Tiam1和Rac1蛋白的表达与人大肠癌浸润和转移密切相关。     

抑制HK-Ⅱ对人结肠癌细胞增殖和化疗敏感性的影响及机制

目的：探讨抑制HK-Ⅱ对人结肠癌细胞增殖和化疗敏感性的影响及可能机制.方法：应用免疫组织化学法检测HK-Ⅱ在人结肠癌细胞中的表达;采用MTT法观察HK-Ⅱ抑制剂（3-BrPA）对人结肠癌细胞增殖的影响和化疗增敏效应;通过Hoechst 33258染色,用共聚焦激光扫描显微镜观察3-BrPA诱导的细胞凋亡;用流式细胞术、紫外分光光度计分别检测细胞死亡率、线粒体膜电位和线粒体膜通透转换孔（PTP）开放的变化.结果：HK-Ⅱ在人结肠癌细胞中阳性表达.3-BrPA能明显抑制人结肠癌细胞增殖,小剂量3-BrPA增加化疗敏感性.3-BrPA可诱导结肠癌细胞凋亡,引起线粒体膜电位下降和PTP开放.结论：抑制HK-Ⅱ可能是通过影响线粒体膜电位和PTP来发挥抗肿瘤作用.     

结肠癌组织中Tiam1的表达与淋巴管生成之间的关系

目的:我们的实验旨在探讨T淋巴瘤侵袭转移基因1(T-cell lymphoma invasion and metastasis1,Tiam1)与结肠癌淋巴管生成的关系。方法:应用SP免疫组化法检测50例经4%甲醛固定、石蜡包埋结肠癌组织中Ti-am1、VEGF-C/D以及淋巴管密度(LMVD)的表达情况。结果:Tiam1阳性表达组VEGF-C阳性率为64.3%,Ti-am1阴性表达组VEGF-C阳性率为25.0%,二者差异有统计学意义,P=0.039;Tiam1阳性表达组LMVD为11.35±3.34,Tiam1阴性表达组LMVD为7.38±2.27,二者差异有统计学意义,P=0.002。结论:Tiam1过量表达可能与结肠癌淋巴管生成有关。     

Tiam1基因沉默降低结肠癌细胞VEGF-C/-D的表达

目的 探讨T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiaml)的表达与结肠癌淋巴管生成的关系.方法 将实验细胞分为3组,分别为未干扰组(HCT116)、空质粒载体对照组(HCT116/CN)和干扰组(HCT116/siRNA-Tiaml).应用siRNA使Tiaml基因表达下调,通过RT-PCR检测Tiaml mRNA表达抑制率,并用RT-PCR和Western blot方法检测Tiaml基因干扰前后VEGF-C/-D mRNA和蛋白的表达情况.结果 通过筛选后稳定表达的情况下,siRNA组的Tiaml、VEGF-C/-DmRNA和蛋白的表达明显低于未干扰组.结论 Tiaml参与了VEGF-C/-D表达的调节,推测Tiaml可能通过诱导VEGF-c/一D的表达影响结肠癌淋巴管的生成.Tiaml可作为结肠癌淋巴转移过程中一个有价值的指标.     

大孔树脂柱层析分离青蒿不同提取物对结肠癌HT-29、Lovo细胞NF-κB活性的影响

目的 通过比较青蒿水煎液经大孔树脂柱层析后所得粗提物对结肠癌HT-29、Lovo细胞核因子-kB(NF-kB)活性的影响,寻找青蒿中对结肠癌细胞NF-kB活性有作用的洗脱相.方法 青蒿水煎液浓缩后加样,AB-8大孔树脂吸附后行柱层析,分别用蒸馏水、30%、50%、75%和95%乙醇对其进行洗脱,收集回旋浓缩得到的不同洗脱相粗提物.MTT法检测经不同浓度(0、50、100、200、400、600μg/ml)的不同洗脱相处理24h后HT-29细胞的活力,以选择粗提物的工作浓度.将HT-29、Lovo细胞分别设为对照组(不加处理因素)和经MTT法检测后获得工作浓度的30%乙醇相组、50%乙醇相组、75%乙醇相组、95%乙醇相组、流出相组,孵育24h后收集细胞,提取细胞核蛋白,采用凝胶阻滞分析(EMSA)法对NF-kB出活性进行测定.结果 MTT法检测发现各相浓度为400、600μg/ml时,HT-29细胞活力均较其他浓度明显降低(P<0.01),因此本实验选择200μg/ml作为工作浓度用于后续实验.HT-29细胞和Lovo细胞经不同洗脱相的青蒿粗提物处理后,以30%乙醇相组的NF-kB活性降低最为明显(积分光密度值分别为29.81±1.62,30.1±1.09),与对照组(积分光密度值分别为55.31±1.07,66.73±1.49)比较有统计学差异(P<0.01),而50%乙醇相组、75%乙醇相组、95%乙醇相组和流出相组NF-kB出活性与对照组比较无统计学差异.结论 青蒿水煎液采用大孔树脂柱层析分离,30%乙醇洗脱相粗提物(200μg/ml)对结肠癌HT-29细胞、Lovo细胞NF-kB出活性具有抑制作用.     

B7—CD28／CTLA—4共刺激途径与GVHD

异基因骨髓移植是目前治疗血液系统疾病的一个有效的方法，移植物抗宿主病（GVHD）则是影响移植效果的主要并发症。移植物中所含有的成熟T细胞是导致GVHD的免疫活性细胞，而T细胞的活化不仅需T细胞上TCR分子识别APC细胞所提呈的MHC－多肽复合物，还必须有辅助分子传递的共刺激信号，否则即可造成T细胞的免疫无反应状态，B7是其中最重要的共刺激分子，为此干预B7－CD28共刺激途径诱导抗原特异性的无反应状成，近年来成为GVHD预防策略的研究热点。     

浅谈医学临床带教中的几点体会

临床带教过程中,带教教师需要有高度的责任心,从临床实习前充分准备、临床思维能力的培养、病历书写质量、培养职业道德、培养医患沟通能力等方面着手,使学生顺利完成从医学生向临床医生的转变。