甲硫腺苷磷酸化酶与肿瘤关系的研究进展

甲硫腺苷磷酸化酶 ( 5’ MethylthioadenoninePhosphorylase ,MTAP) ,EC∶2 4.2 .2 8,最初缩写为MSAP或MTAPase ,是嘌呤和甲硫氨酸合成补救途径中一个关键的酶[1] ,属于嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)家庭 2的成员之一 ,其活性形式是同源三聚体 ,有碱基、甲硫核糖和巯基 /磷酸结合位点。MTAP在正常细胞和组织中表达很丰富 ,但在人或鼠来源的多种恶性细胞系和人类多种肿瘤如乳腺癌[2 ] 、白血病[3 ] 、骨肉瘤[4] 、口腔癌[5] 、子宫癌[6] 和肺癌[7] 等中有较高频率的纯合性缺失现象。利用MTAP在多种肿瘤中表达缺失的特点 ,通过甲硫氨酸饥…     

重组结核分枝杆菌PPE17蛋白原核可溶性表达纯化和血清学诊断研究

目的利用原核系统可溶性表达结核分枝杆菌PPE17蛋白并进行纯化,研究其免疫学特性,并评价该重组蛋白在结核病血清学诊断方面的价值。方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中利用PCR扩增PPE17核酸序列然后克隆至融合表达载体pET-DsbC中,转入大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,用Western Blot和EL ISA方法进行抗原性初步评价。结果融合蛋白Ds-bC-PPE17在原核系统内经IPTG诱导表达后,主要以可溶性形式表达存在,经镍柱层析获得了纯的重组蛋白,纯度达95%以上。Western Blot和EL ISA方法结果证明重组DsbC-PPE17蛋白具有较强的抗原活性。用纯化的PPE17蛋白做抗原,临床诊断结核病人血清,阳性率达60%。结论融合蛋白DsbC-PPE17在大肠埃希菌中以可溶性表达形式存在,高纯度的重组融合蛋白有可能成为结核病的血清学诊断抗原。     

16S-23S rDNA间隔区序列寡核苷酸探针对结核患者痰标本的检测

目的：应用结核分枝杆菌特异的寡核苷酸探针杂交检测结核患者痰标本中的结核分枝杆菌，以评价其在临床应用中的价值。方法 对生物素标记５‘－端的一个２０ｂｐ的寡核苷酸探针的敏感性、特异性的研究，并应用该探针对９０例结核患者和３０例非结核患者痰标本进行了检测。结果 寡核苷酸探针分别检测基因组ＤＮＡ、３５０ｂｐ ＰＣＲ扩增产物、２５０ｂｐ ＰＣＲ扩增产物的敏感性分别为５５ｎｇ，０．５ｎｇ，０．１ｎｇ。探针检测     

巨细胞病毒gp52蛋白原核可溶性表达与应用

目的 生物工程方法在原核系统内可溶性表达巨细胞病毒gp52蛋白并进行纯化,获得可以用于检测巨细胞病毒特异性抗体的重组抗原. 方法 利用PCR扩增获得巨细胞病毒gp52核酸序列,然后克隆至pET-DsbC核融合表达载体中,在原核系统进行诱导表达并纯化,用Western blot和ELISA检测其抗原性及实用性. 结果 表达纯化的Ds-bC-gp52融合蛋白分别经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份抗巨细胞病毒IgM阳性血清和60份阴性血清.其中用酶标记DsbC-gp52蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率达96.6％,阴性检出率100％. 结论 融合蛋白DsbC-gp52在大肠杆菌中主要以可溶性表达形式存在,获得的高纯度融合蛋白抗原性和特异性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于临床检测风疹病毒的早期感染.     

结核分枝杆菌临床分离株利福平耐药表型及rpoB基因型分析

目的分析结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株利福平(rifampin,RFP)耐药表型及rpoB基因突变关系,阐明MTB RFP耐药株rpoB基因突变特征。方法采用改良罗氏培养基比例法检测387株MTB临床分离株对RFP敏感性,并进行rpoB基因测序。对经测序rpoB基因511位和533位密码子突变株进行RFP最小抑菌浓度(MIC)检测。结果比例法检测387株MTB临床分离株中1,98株RFP耐药株,189株RFP敏感株。rpoB基因测序结果表明1,98株比例法RFP耐药株中1,92株(96.97%)发生rpoB基因突变,涉及16种单位点和24种双位点密码子联合突变类型,单位点和双位点密码子联合突变率分别为84.34%(167/198)和12.63%(25/198),其中发现1种单位点和21种双位点密码子联合突变新类型。最常见的突变位点为531位(51.01%)、526位(21.21%)和516位(7.07%)密码子。6株(3.03%)耐药株在rpoB测序范围内未见突变。189株比例法RFP敏感株中,174株(92.06%)在rpoB基因测序范围内未见突变1,5株(7.94%)发生突变,其中7株CTG511CCG(Leu→Pro)突变和6株CTG533CCG(Leu→Pro)突变。511位和533位密码子突变株MIC检测结果提示其突变与低度耐RFP相关。结论所得数据及一些新的发现为进一步研究MTB RFP耐药机制、研制快速新型分子药敏试验方法提供理论和实际应用依据。     

结核分枝杆菌19-kDa蛋白在大肠杆菌中的表达

目的通过基因工程技术获得重组结核分枝杆菌19-kDa蛋白。方法应用PCR技术扩增结核分枝杆菌H37Rv19-kDaDNA序列;以质粒pET24b为表达载体,构建19-kDa重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3);在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,分别对不同诱导时间的表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),凝胶经考马斯亮蓝染色检测蛋白。结果重组质粒pET24b-19-kDa测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以可溶性形式表达。不同IPTG诱导时间实验表明重组结核分枝杆菌19-kDa蛋白诱导3~4h重组蛋白在大肠杆菌中的表达量最高。结论pET24b-19-kDa大肠杆菌工程株可高表达结核分枝杆菌重组19-kDa蛋白。     

结核分枝杆菌phoS2基因在大肠埃希菌中的高效表达及其产物抗原性分析

目的在大肠埃希菌中高效表达结核杆菌phoS2,通过免疫印迹反应初步鉴定重组蛋白的抗原性和特异性。方法采用DNA重组技术构建结核分枝杆菌phoS2抗原表达载体,用双酶切和PCR等方法鉴定转化子,重组质粒转化大肠埃希菌,诱导表达phoS2;用SDS-PAGE初步鉴定其表达量;将表达产物进行纯化;重组蛋白用Western blot分析其抗原性和特异性。结果phoS2基因在大肠埃希菌中得到高效表达,表达量占全菌蛋白的40％以上;重组蛋白与结核病患者血清标本呈强阳性反应,与健康人血清标本呈阴性反应。结论重组phoS2蛋白在大肠埃希菌中主要以包涵体形式表达,有很好的抗原特异性和免疫原性,对结核病诊断有潜在的应用价值。