自然杀伤细胞参与脑缺血后损伤的作用机制

目的 探讨自然杀伤细胞(NK)参与脑缺血后损伤的作用机制.方法 ①体内实验:免疫荧光检测永久性大脑中动脉栓塞(pMCAO)小鼠模型脑组织中NK细胞浸润情况以及干扰素(IFN)-γ表达情况;流式细胞术检测pMCAO小鼠模型脑中NK细胞浸润数目和IFN-γ表达;腹腔注射NK细胞中和抗体,流式细胞术检测pMCAO小鼠12 h脑内NK细胞浸润情况.②体外实验:建立体外血脑屏障并加入NK细胞和荧光标识的牛血清白蛋白(BSA-FITC),氧糖剥夺(OGD)实验6h后荧光分光光度计检测血脑屏障通透性;将NK细胞与小鼠神经细胞共培养,并加入IFN-γ阻断剂,OGD6h后流式细胞术检测神经细胞凋亡.结果 ①体内实验示pMCAO小鼠脑中有NK细胞浸润和IFN-γ表达,与非缺血侧相比,缺血侧的NK细胞浸润显著增多并于12 h达到高峰(P12h＜0.001);脑缺血组织中浸润的NK细胞表达IFN-γ与非缺血侧相比增多(P12h＜0.001、P24h＜0.01、P96h ＜0.05);清除体内NK细胞后,pMCAO小鼠脑内NK细胞浸润显著减少(P＜0.001),脑内IFN-γ表达显著下降(P ＜0.001).②体外实验示OGD条件下,NK细胞组与对照组相比,BSA-FITC渗透显著增多(P＜0.01);NK细胞可促进神经细胞死亡(P＜0.01).结论 NK细胞参与脑缺血损伤过程;NK细胞通分泌IFN-γ加重血脑屏障破坏和神经细胞损伤.     

IL-12和IL-18在实验性自身免疫性神经炎中的协同作用机制

目的:研究IL-12和IL-18分别在实验性自身免疫性神经炎(EAN)中的调节机制以及IL-12与IL-18的协同作用.方法:建立P0180-199特异性T细胞系.分别用IL-12或IL-18或者IL-12和IL-18进行体外干预,将不同处理组的T细胞回输到正常的大鼠体内,建立过继免疫的EAN动物模型.应用国际分级标准和临床评分对发病鼠进行临床评定;通过免疫组化检测不同组EAN鼠坐骨神经淋巴细胞浸润;ELISA法检测相关细胞因子的变化.结果:①在IL-12和IL-18共同干预的条件下,特异性T细胞TNF-α和IFN-γ的产生均增加;②与IL-12或IL-18组相比,IL-12 IL-18组大鼠临床发病明显加重,发病时间提前;③在坐骨神经标本中,与对照组相比,IL-12 IL-18组CD4 淋巴细胞浸润数量较多,而IL-12和IL-18组CD4 淋巴细胞浸润较少.结论:经IL-12和IL-18体外干预的P0180-199特异性T淋巴细胞,通过过继免疫给正常大鼠后,诱导出严重的EAN动物模型,表现出协同增强作用.     

体外诱导骨髓基质干细胞向神经细胞分化及蛋白的差异表达***☆

背景：骨髓基质干细胞移植对损伤脊髓有一定修复作用，较神经干细胞移植更为理想，但疗效并不稳定，可能与其移植微环境有关。 目的：拟建立体外神经细胞微环境作用下骨髓基质干细胞的分化模型，观察其分化过程中蛋白表达的差异。 设计、时间及地点：蛋白水平的观察对照实验，于2005-07/2007-05在哈尔滨医科大学基础医学院神经生物实验室完成。 材料：Wistar成年大鼠及新生胎鼠。 方法：取新生Wistar胎鼠脊髓，以培养神经细胞。从成年Wistar大鼠骨髓中分离骨髓基质干细胞进行体外培养和增殖，应用红色荧光蛋白PKH26标记骨髓基质干细胞。骨髓基质干细胞、神经细胞单独培养组分别将骨髓基质干细胞、神经细胞单独培养，共培养组、分层联合培养组分别将标记的骨髓基质干细胞与神经细胞在体外共培养及在双层培养皿中联合培养。 主要观察指标：培养7 d后收集细胞分别进行神经特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光检测。应用 SELDI-TOF-MS 技术筛选骨髓基质干细胞向神经细胞分化过程中变化明显的相关蛋白进行分析。 结果：骨髓基质干细胞与神经细胞共培养和双层联合培养7 d后，骨髓基质干细胞呈类似神经细胞形态。免疫荧光检测结果示，共培养组骨髓基质干细胞的神经特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白阳性率明显高于分层联合培养组（P < 0.05），分层联合培养组明显高于单独培养对照组（P < 0.05）。骨髓基质干细胞在向神经细胞转化过程中有5种蛋白表达发生明显变化：在分层联合培养组TIP39_RAT和CALC_RAT表达增加，为原表达量的5.344和2.805倍；INSL6_RAT，PNOC_RAT和PCSK1_RAT表达下降，为原表达量的0.380，0.499和0.437倍。 结论：在体外神经细胞微环境作用下，骨髓基质干细胞与神经细胞在共培养和双层联合培养时均能诱导分化成神经细胞，接触培养比非接触培养分化率高。骨髓基质干细胞在向神经细胞转化过程中与5种蛋白TIP39_RAT，CALC_RAT，INSL6_RAT，PNOC_RAT和PCSK1_RAT密切相关。     

大鼠脑缺血后胶质细胞向树突状细胞转化的研究

目的　探讨缺血脑组织中树突状细胞 (DC)的来源 ,以其及是否参与脑缺血损伤的过程。方法　用线栓方法封闭大鼠右侧大脑中动脉制作动物模型。用免疫组化染色法 ,检测脑缺血 1h到第 6天时 ,缺血脑组织中DC(OX6 2 + )的存在 ,以及胶质细胞 /巨噬细胞 (OX4 2 + )转化成DC(OX6 2 + )的情况。同时检测活化后的DC样细胞表达MHC Ⅱ类分子的水平。结果　缺血脑半球和假手术的脑半球相比较 ,在 12hDC的数量明显增加 (P <0 .0 0 1)。在脑缺血组中 ,缺血脑半球与非缺血脑半球相比较 ,DC的数量也增多 (P <0 .0 0 1)。脑缺血第 6天 ,缺血组与假手术组进行比较 ,DC表达MHC Ⅱ类分子 (OX6 2 + OX6 + )显著升高(P <0 .0 0 1)。缺血脑半球在 1h到第 6天 ,OX4 2 + 的细胞转变成OX6 2 + OX4 2 + 的细胞逐渐增加 ,第 6天缺血脑半球与非缺血脑半球相比较显著增多 (P <0 .0 0 1)。脑缺血损伤的面积与以每 10 0mm2 脑组织切片为单位的OX6 2 + 细胞的数量呈正相关 (R2 =0 .8914 ,P <0 .0 0 1)。结论　脑缺血后 ,脑缺血组织中DC数量的增加与脑损伤的面积呈正相关 ,提示DC参与了脑缺血过程。大鼠脑缺血后 ,从胶质细胞向DC样细胞的转化是缺血脑组织中DC的来源之一。     

脑缺血发生后 IP－10趋化 NK 细胞通过血脑屏障

目的：探讨脑缺血发生后 IP－10对NK细胞的趋化作用。方法体内实验：免疫荧光染色观察永久性大脑中动脉栓塞小鼠模型（ pMCAO）脑组织中NK细胞浸润情况以及IP－10、CXCR3表达情况;流式细胞术检测pMCAO小鼠模型脑中NK细胞浸润数目;RT－PCR检测pMCAO小鼠模型脑中IP－10表达。体外实验：建立体外血脑屏障;ELISA检测氧糖剥夺（oxygen－glucose deprivation, OGD）6 h后内皮细胞和神经细胞上清IP－10表达;将体外血脑屏障分成NK组、 NK＋IP－10 blockade组,上层加入BSA－FITC,OGD 6 h后荧光分光光度计检测血脑屏障通透性,流式细胞术检测NK细胞迁移数目;向纯化的NK细胞中分别加入IP－10（10 ng／mL）、IP－10（50 ng／mL）和IP－10（100 ng／mL）,流式细胞术检测CXCR3表达几何平均荧光强度。结果 pMCAO小鼠模型脑中有NK细胞浸润且表达CXCR3; NK细胞浸润缺血侧多于非缺血侧,12 h达到高峰（ P＜0．05）后逐渐下降,96 h开始略有升高;pMCAO小鼠模型脑中有IP－10表达,并于12 h达到高峰（ P＜0．001）后逐渐下降。体外实验：OGD后神经细胞表达IP－10较内皮细胞明显增多（ P＜0．001）;与NK组相比,NK＋IP－10 blockade组NK细胞迁移数目明显减少（ P＜0．05）;NK细胞表达CXCR3水平随IP－10作用浓度升高而升高。结论①NK细胞参与了脑缺血损伤过程;②脑缺血发生时IP－10通过与NK细胞表面表达的CXCR3结合,趋化NK细胞进入脑组织,并存在剂量依赖性。     

模拟微重力条件对神经细胞分泌功能的影响

目的分析微重力条件下和正常重力条件下神经细胞培养的上清液中蛋白质表达的差异。方法用旋转细胞培养系统提供的微重力环境进行神经细胞微重力培养。应用表面增强激光解吸离子化（SELDI）蛋白质芯片技术检测微重力和正常重力条件下神经细胞培养上清液的蛋白质谱。用PBSII—C型蛋白质芯片阅读机读取数据,采用Ciphergen Protein Chip3．2．1软件分析数据。结果WCX2两种蛋白芯片共捕获246个蛋白峰,发现14个差异蛋白。与正常重力培养组蛋白谱相比,11个蛋白在微重力培养后高表达,3个蛋白在微重力培养后低表达。结论微重力条件下和正常重力条件下神经细胞培养的上清液中存在差异蛋白表达,这些差异蛋白为进一步了解失重对神经细胞的影响提供了重要线索。     

免疫功能正常的巨细胞病毒性脑炎一例

病例报告 男，22岁，既往体健。1994年4月入院。入院前4d曾患感冒，发热，体温37．2℃。伴周身不适，持续1d。入院前1d出现头痛，抽搐发作一次。查体神志清楚，记忆力轻度减退，计算力减退，右上：下肢肌力Ⅲ～Ⅳ级，腱反射亢进，右Babinski( )。入院第3日后又有数发痫性发作，呈意识丧失，右上下肢强直，     

PCR快速检测病毒性脑炎患者脑脊液中HSV、CXV和CMV

本文应用聚合酶链反应(PCR)和逆转录PCR(RT-PCR)技术检测了27例临床诊断为病毒性脑炎患者和25例其他神经疾病(OND)对照组患者脑脊液(CSF)中单纯疱疹病毒(HSV)、柯萨奇病毒(CXV)和巨细胞病毒(CMV)。27例患者组检出HSV13例、CXV2例、CMV1例，总阳性率为59．3％，而OND对照组皆为阴性。随着检测技术的完善及对更多种类病毒采用PCR早期快速诊断方法的建立，将有效地指导特异性抗病毒药物的选择应用，从而提高治愈率，降低病死率和改进预后。     

M3受体与大鼠缺血性心肌细胞凋亡关系的研究M3受体与大鼠缺血性心肌细胞凋亡关系的研究

目的观察M₃受体对大鼠缺血性心肌细胞凋亡的作用及其机制。方法结扎大鼠左冠状动脉前降支建立急性心肌缺血模型,给予M₃受体激动剂胆碱或阻断剂4DAMP进行干预,观察M₃受体对其的影响。结果缺血前15 min iv胆碱10 mg·kg^-1可提高血清超氧化物歧化酶(SOD)活力,降低丙二醛(MDA)含量,减少凋亡细胞的数量(P<0.01),并可增加Bcl-2表达,减少Fas表达。预先5 min iv 4DAMP 0.12 mg·kg^-1阻断心肌M₃受体可逆转胆碱的作用。结论激动M₃受体对结扎大鼠冠状动脉诱导的心肌损伤有保护作用,其机制可能与调节Bcl-2和Fas表达从而抑制心肌细胞凋亡有关。     

M3受体对体外H2O2诱导大鼠心肌细胞凋亡的保护作用

目的探讨M₃受体激动对H₂O₂诱导的大鼠培养心肌细胞凋亡的作用，进一步阐明其机制。方法末端标记法 (TUNEL)进行细胞凋亡检测；免疫组化方法检测Bcl-2和Fas的表达；共聚焦显微镜观察［Ca²⁺］_i荧光强度变化。结果M₃受体激动剂胆碱(10 mmol·L^-1)可减少H₂O₂诱导的心肌细胞凋亡的数量，并可增加心肌Bcl-2的表达，减少Fas表达，抑制H₂O₂诱导的［Ca²⁺］_i荧光强度的升高。但预先应用4DAMP (10 nmol·L^-1)阻断M₃受体可逆转胆碱作用。结论激动M₃受体对H₂O₂诱导的心肌细胞凋亡有保护作用，其机制可能与Bcl-2和Fas表达以及下调［Ca²⁺］_i有关。