体外诱导人骨髓间充质干细胞定向肝细胞分化

目的:研究人骨髓间充质干细胞向肝细胞的诱导分化,为肝组织工程提供理想的细胞来源。方法:以肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4对种植于基底膜基质中的人骨髓间充质干细胞进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间,分别进行形态观察、AFP、Alb的免疫组化荧光染色及靛青绿的摄取与排泌试验。结果:该条件下诱导后的人骨髓间充质干细胞生成肝细胞样细胞,阳性表达肝细胞特有表面标志AFP、Alb,并具备肝细胞特有的摄取与排泌靛青绿的活性功能。结论:肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4及基底膜基质可能在体外人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在肝组织工程中的应用提供了理论与技术上的支持。     

乙型肝炎病毒X基因在真核细胞中的表达及反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应 (ＰＣＲ)扩增ＨＢＶＸ基因 ,克隆至真核表达载体ｐＶＲ10 12中 ,构建ＨＢＶＸ基因重组表达载体ｐＶＲ10 12 Ｘ。以该质粒转染ＨｅｐＧ2细胞 ,酶联免疫吸附法 (ＥＬＩＳＡ)检测细胞Ｘ蛋白的瞬时表达 ,与报告质粒ｐＳＶ ｌａｃＺ共转染ＨｅｐＧ2细胞 ,用试剂盒法检测β 半乳糖苷酶表达活性。结果质粒 ｐＶＲ10 12 Ｘ在ＨｅｐＧ2细胞瞬时表达Ｘ蛋白 ,共转染实验中ｐＶＲ10 12 Ｘ组β 半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的 3.2倍 ,表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达 ,并能够反式激活ＳＶ4 0早期启动子。乙型肝炎病毒X基因在…     

明胶酶在脑胶质瘤大鼠中的活性

目的：通过观察脑胶质瘤大鼠动物模型中明胶酶的活性变化，为以明胶酶为靶点的脑胶质瘤治疗奠定实验基础。方法：实验于2004-10／2005-12在解放军军事医学科学院野战输血研究所干细胞生物学研究室完成。9L大鼠胶质瘤细胞购自广州南方医科大学。①选取清洁级健康成年雄性Fisher344大鼠27只，24只建立大鼠脑胶质瘤模型，造模后随机数字表法分为建模后7，14，21，28d组，6只／组，每组3只用于灌注固定做免疫组化分析，另3只用于反转录多聚酶链反应和明胶酶谱分析。剩余3只大鼠作为正常对照。②采用反转录多聚酶链反应技术、免疫组织化学和明胶酶谱等方法检测胶质瘤中明胶酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）和明胶酶9（matrix metalloproteinase 2，MMP-9）的活性变化。结果：实验选取清洁级健康成年雄性Fisher344大鼠27只，全部进入结果分析。①MMP-2和MMP-9mRNA的表达：9L胶质瘤细胞中均可见MMP-2和MMP-9mRNA的表达，MMP-2的表达量高于MMP-9；大鼠脑胶质瘤组织中可见两者mRNA的表达，而正常脑组织MMP-2mRNA低表达，检测不到MMP-9mRNA的表达；随着肿瘤的生长，MMP-9mRNA的表达量增高。②MMP-2和MMP-9免疫组织化学观察结果：9L胶质瘤细胞的免疫组化显示，MMP-2和MMP-9均呈现阳性染色，主要为胞浆和胞膜染色；肿瘤组织MMP-2和MMP-9染色阳性，为胞浆染色，在血管内皮和肿瘤侵袭边缘细胞胞阳性染色明显。随脑胶质瘤的生长，MMP-2和MMP-9染色程度加深。③MMP-2和MMP-9酶活性检测结果：9L细胞无血清培养上清中可见Pro—MMP2（Mr72000）与Pro—MMP9（Mr92000）及其活化形式activeMMP-2（Mr 66000）与activeMMP-9（Mr83000）的表达，MMP-2的表达量较高；MMP-2酶原与活化的MMP-2在脑胶质瘤组织中明显表达，而在正常脑组织低表达。MMP-9酶原与活化的MMP-9在脑肿瘤组织中表达，正常脑组织中未检测到其表达。④MMP-2和MMP-9在肿瘤组织中的定位情况：脑胶质瘤组织冰冻切片原位明胶酶谱结果显示，肿瘤组织因表达活性的明胶酶降解载片上的明胶，致使不被染色，肿瘤部位很透亮。对侧脑组织因不表达明胶酶，不能降解明胶，被染黑。结论：脑胶质瘤模型中表达高活性的MMP-2和MMP-9，且与胶质瘤生长速度密切相关。     

丙型肝炎病毒核心蛋白人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的人源单链可变区抗体（ScFv)。方法 采用噬菌体表面展示技术，以重组的HCV核心蛋白为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得抗原结合活性较强的HCV核心蛋白特异性人源单链可变区抗体片段阳性克隆，并对其进行免疫学及核苷酸序列测定。结果 筛选得到的ScFv片段具有抗HCV核心蛋白的特异性，基因序列分析结果表明符合人源单链可变区抗体基因序列的结构特征。结论 利用噬菌体抗体库技术，成功获得HCV核心蛋白的特异性人源单可变区抗体的编码基因。     

HCV非结构蛋白NS5A人源单链抗体可变区基因的筛选与鉴定

非结构蛋白ＮＳ5Ａ是丙型肝炎病毒(ＨＣＶ)编码的一种蛋白分子。我们利用重组的ＨＣＶ非结构蛋白ＮＳ5Ａ为包被抗原 ,从噬菌体抗体库中筛选出了结合活性较强的ＨＣＶＮＳ5Ａ人源单链噬菌体抗体 ,并对其进行了ＤＮＡ序列测定。本研究所用的ＨＣＶＮＳ5Ａ抗原为大肠杆菌表达的重组纯化抗原蛋白 ,以聚丙烯酰胺凝胶电泳 (ＰＡＧＥ)证实纯度在95 %以上。人噬菌体抗体文库为轻链可变区和重链可变区经甘氨酸接头(Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ) 3 连接的半合成抗体文库。Ｍ13Ｋ0 7购于Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司 ,ＤＮＡ质粒提取纯化试剂盒购于Ｗｉｚａｒｄ公司。其…     

大鼠肝再生增强因子假基因的克隆化与序列分析

目的 研究大鼠肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）在大鼠基因组织中的存在方式。方法 以大鼠基因组DNA为模板,根据ALP cDNA序列设计引物,用多聚酶链反应（PCR）扩增产物,连入pGEM Teasy Vector后测序。结果 PCR法扩增出两条产物,其一经测序发现为ALR的假基因,预测氨基酸序列与ALR的同源性为88.8%。结论 作为肝细胞再生过程中重要的生长刺激因子,大鼠ALR存在假基因,提示可能存在ALR多基因家族。为研究ALR分子的进货规律提供了依据。     

乙型肝炎病毒表面抗原一级结构多态性的初步研究

目的 研究慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原一级结构的多态性。方法 设计特异性引物，自7例慢性乙型肝炎患者血清中扩增S基因全长或全基因组片段，TA克隆法克隆到T载体中，随机选择克隆测序。结果 共20个克隆被测序。20个克隆全S蛋白的总一致率仅为32．0％，13株全长为401氨基酸残基的克隆氨基酸一致效率为82．5％。患者血清中发现2株克隆编码截短型表面抗原中蛋白，在前S1或前S2的免疫决定区或可能的肝细胞结合部位均发现缺失突变。结论 慢性乙肝患者体内存在HBV准种群，病毒编码的截短型表面抗原中蛋白可为HBV诱导原发性肝癌提供一种途径，应加强对HBsAg一级结构多态性的研究。     

乙型肝炎病毒C基因启动子区准种与变异特点的研究

目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)C基因启动子区难种与变异的特点。方法 以中国株HBV基因序列为依据，设计特异性聚合酶链反应(PCR)引物，自3例慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBVCP序列，克隆入pGEM Teasy质粒，随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果 测序结果发现HBV CP序列高度保守，但在TATA样盒(1—3)可发生多种突变，其中184nt(T→C)位替换突变员为常见；在直接重复序列(DR)I上游存有一缺失突变高发区33．3％(5／15)。结论 CP区内有一缺失高变区，TATA样盒3的变异可能影响前C蛋白的表达。结果 提示HBV长期携带者体内有HBV准种共存。     

HBsAg人源噬菌体单链抗体的筛选及其在临床诊断中的应用

目的 筛选乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)的人源噬菌体单链抗体，并探讨其在临床治疗和诊断中的应用价值。方法 以HBsAg阳性血清超速离心纯化的HBsAg为固相抗原，从噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过5轮“吸附—洗脱—扩增”筛选过程，获得特异性较强的HBsAg人源单链可变区抗体(ScFv)；用该抗体对10例石蜡包埋的乙型肝炎患者肝组织进行免疫组化鉴定。结果 酶联免疫吸附法(ELISA)结果表明，制备的HBV人源单链抗体能与HBsAg抗原特异性结合；免疫组化结果表明，该抗体能够特异性识别乙型肝炎患者肝组织中的HBsAg抗原，与正常肝组织及丙型肝炎病毒(HCV)的抗原均无交叉反应。结论 此法制备的单链抗体亲和性好，特异性强，且制备方法简便，周期短，为HBV病原的检测提供了新的有效试剂，为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定了基础。