四环素调控白喉毒素基因的重组逆转录病毒载体的构建

将毒素基因导入肿瘤细胞内是肿瘤基因治疗一个较有前景的手段[1].白喉毒素(diphtheria toxin,DT)是由白喉杆菌分泌的一种单链多肽毒素,大多数哺乳类细胞均存在这种毒素的受体,其A片段(DTA)毒力特别强,它能催化不可逆转的ADP核糖酰基化,使肽链延长因子Ⅱ失活,从而抑制宿主细胞蛋白合成[2].Gossen等[3]提出了可调控型高表达系统(Tet系统),这为毒素基因治疗肿瘤开辟了新途径.Tet系统可分为 Tet-On和Tet-Off系统,前者的基因表达是在四环素加入后激活,而后者则是在四环素浓度逐渐降低的情况下激活.我们构建携带四环素系统调控的DTA基因的逆转录病毒载体,为进一步探讨肺癌的基因治疗奠定基础.     

HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库的构建与筛选

目的探讨噬菌体随机肽展示技术在筛选和鉴定病毒抗原序列研究中的应用前景。方法用噬菌粒展示载体pCANTAB5X,构建HCV核心蛋白噬菌体随机展示肽库。用抗-HCV核心单独阳性的血清对该库进行4轮筛选,获得多个阳性克隆,测定和分析8个杂交阳性克隆的DNA序列。结果构建的随机文库含1.23×105个不同克隆,噬菌体滴度为2×1012TU/ml（转化单位/ml）。所测定的7个阳性序列中的6个为HCV核心蛋白序列,这些序列均含有与免疫筛选结果相似的HCV核心抗原序列。另一个为大肠杆菌nrfa基因。结论所建的噬菌体文库有足够大的库容和较好的随机性,可以从该文库中筛选出正确的HCVC抗原序列。噬菌体展示技术完全可应用于病毒蛋白抗原序列的筛选,并具有简便、快速、准确的优点。     

霍乱弧菌单克隆抗体诊断应用的研究——Ⅴ.McAb标记葡萄球菌A蛋白(SPA)作协同凝集试验快速检定霍乱弧菌的实验研究

将霍乱弧菌McAb标记SPA作协同凝集试验,快速检定霍乱弧菌模拟标本,研究其敏感性和能否用于临床检验可行性。结果表明,McAb-COA比PC-COA的敏感性高,前者在10~5/ml即可检出,后者要在10~7/ml才能检出;McAb-COA比PC-COA特异性强,前者对NAG等其它肠道菌仅有极少数菌株有微弱的交叉反应,而后者对较多的肠道菌株有明显的交叉反应。检     

肝脏相关性疾病的组织特异性基因治疗

组织特异性基因治疗是ｉｎｖｉｖｏ基因治疗的首要问题。这种基因治疗包括靶向感（转）染和靶向表达，前者包括定位转染和导向转染，后者就是应用组织特异性转录调控序列和ｍＲＮＡ稳定序列而使治疗基因在靶细胞高效表达。肝脏的结构特性和肝脏疾病的重要性决定了肝病组织特异性基因治疗是重要的和可行的。肝肿瘤、病毒性肝炎及其他肝相关性疾病的组织特异性基因治疗有广阔的前景     

基于16S rDNAs的快速检测血液细菌污染的荧光定量PCR研究

目的 探讨快速筛选血液及血液制品中细菌污染的方法.方法 对20余种常见致病性细菌的16S rDNAs进行多序列比对,设计扩增细菌16S rDNAs基因的荧光定量PCR(FQ-PCR)通用引物.以12种致病菌、2种真菌、1种支原体、1种病毒和人基因组DNA为模板,验证通用引物检测细菌的特异性.通用引物扩增金黄色葡萄球菌16S rDNA靶片段,构建标准质粒pMDT-Bfr,并建立FQ-PCR定量标准曲线.分别以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作为革兰阳性和革兰阴性细菌代表菌,以其不同浓度的DNA为模板进行FQ-PCR反应,检验该方法的敏感性.抽提梯度稀释的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌模拟血液细菌污染标本的总DNA作为FQ-PCR反应模板,检验基于16S rDNAs的FQ-PCR作为血液细菌污染检测方法的敏感性.结果 设计的FQ-PCR通用引物有较高的特异性,仅能检测出细菌的16S rDNAs;用该方法检测革兰阳性和革兰阴性菌,对于浓度在103拷贝/μl以上的16S rDNAs基因都可以准确定量;以该方法检测血液细菌污染模拟标本,灵敏度可达到105CFU/ml.结论 初步建立了以16S rDNAs作为FQ-PCR靶基因快速检测血液细菌污染的方法.该方法特异性强、灵敏度高、成本低廉,具有很好的研究价值与应用前景.     

庚型肝炎病毒转基因小鼠的特性研究

庚型肝炎病毒 (HGV)是一种新发现的与肝炎相关的病毒 ,作者已克隆了 HGV的全长基因 ,并制备了含有庚型肝炎病毒 (HGV)全长基因的转因基小鼠。作者以本室构建的 HGV转基因小鼠为材料 ,取转基因小鼠的各种组织进行 RT- PCR、免疫组织化学、Westernblotting等实验 ,分析 HGV基因在转基因小鼠体内的复制、表达及前体蛋白的剪切。并以外周血单核细胞(PBMC)及血清 RNA阳性的转基因小鼠血清接种Molt- 4细胞 ,鉴定细胞及上清中的 HGV RNA以及HGV病毒颗粒 ,研究 HGV的传染性。结果发现 HGV的正、负链 RNA以及蛋白产物可以在多个组…     

重组腺病毒介导IL-12、IL-2联合基因治疗前列腺癌的实验研究

目的　探讨转移性前列腺癌的治疗方法 ,为前列腺癌免疫基因治疗提供实验依据。　方法　采用重组腺病毒介导IL 12、IL 2联合免疫基因疗法 ,对 6 6只C5 7BL/ 6小鼠前列腺癌模型进行致瘤性和抑瘤性观察。　结果　腺病毒AdmIL 12、AdhIL 2能有效表达目的基因。接种野生型 ,转AdLacZ及转AdmIL 12、AdhIL 2混合RM 1细胞的小鼠致瘤比例分别为 10 / 10、10 / 10及 2 / 10 ;成瘤时间分别为 (12 .3± 1.5 )d、(12 .8± 1.0 )d、(2 2 .5± 2 .1)d ;接种 30d后肿瘤结节直径分别为 (35 .0±2 .0 )mm、(34 .0± 2 .6 )mm、(10 .5± 3.5 )mm。与对照组相比 ,转AdmIL 12、AdhIL 2基因RM 1细胞小鼠致瘤率下降 ,成瘤时间延迟 (P <0 .0 1)、瘤结节小 (P <0 .0 1)。AdmIL 12、AdhIL 2瘤体注射还可抑制肿瘤生长 (P <0 .0 1) ,减少肺转移灶数目 (P <0 .0 1)。　结论　IL 12、IL 2联合基因治疗可诱发前列腺癌小鼠的肿瘤特异性免疫反应。     

人脐血白细胞干扰素纯化研究

本文报告的人脐血IFN纯化系统包括两步,第一步为“粗提”,系采用KCNS-酒精法;第二步为“精提”,系采用蓝葡聚糖-Sepharose 4 B(BDS)柱层析法。结果表明:沉淀粗制IFN的最适条件是0.5MKCNS.pH4.0;析出IFN的最佳pH是5.5～7.2,KCNS盐析一次与两次结果大致相同;冰镇酒精保冷普通离心机离心,对酒精溶液中的IFN活性无明显影响。经第一步纯化,IFN回收70％左右,比活性约为10~6国际单位/mg蛋白;第二步回收40％以上,纯度达10~7国际单位/mg蛋白。 本实验为临床IFN的纯化提供了依据,对其他类型IFN的纯化也有参考意义。     

动物生物安全三级实验室的使用体会

根据生物安全实验室的分级,结合动物生物安全三级实验室的使用体会,阐述生物安全三级实验室的人员准入制度、工作人员行为准则以及突发状况下人员的撤离,对动物生物安全三级实验室的安全使用及管理提供借鉴作用.