重组人干细胞因子菌种稳定性鉴定

细胞因子(stem cell factor，SCF)是一种对造血细胞有重要作用的因子，它主要作用于早期多能干细胞、祖细胞，同时对晚期成熟血细胞也有作用，在肿瘤放疗和化疗的辅助治疗、体外造血、骨髓移植等方面有着广阔的应用前景。为了满足临床和科研工作对rhSCF的需求，本所已构建了高效表达rhSCF的工程菌DH5α(pMG604）。菌种的稳定性是     

重组人干细胞因子工程菌的培养研究

目的：对工程菌DH5a(pMG604)的批次补料培养和连续补料培养工艺进行研究。方法：通过摇瓶试验筛选适合重组人干细胞因子工程菌DHSa(pMG604)生长和产物表达的基础培养基，在此基础上进行了分批补料批培养和连续补料批培养的研究。结果：30L发酵罐分批补料批培养，菌密度为11．9(D600)，rhSCF表达水平为42％。5L发酵罐连续补料批培养，最终菌密度为148(D600)，rhSCF表达水平为31％。     

人sTNFR II-IgG Fc融合蛋白在毕赤酵母菌中的表达及其产物分析

目的:在毕赤酵母菌中表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白。检测融合蛋白是否形成二聚体,并对其N-糖链进行分析。方法:从人淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增目的基因sTNFRII与IgG Fc,然后利用重叠延伸PCR得到嵌合体基因sTNFRII-IgG Fc,并将其插入pPIC9载体中。以重组载体转化巴斯德毕赤酵母菌中进行克隆与表达。采用ELISA筛选高表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白的重组毕赤酵母菌株,对融合蛋白通过还原和非还原SDS-PAGE分析其二聚体结构,采用L929细胞检测融合蛋白抗TNF-α的生物学活性,最后利用荧光辅助糖电泳(FACE)分析融合蛋白的N-糖链。结果:成功地建立了可分泌表达sTNFR II-IgG Fc融合蛋白的重组酵母菌株,摇瓶培养后融合蛋白的表达量为2mg/L。SDS-PAGE和Western blot表明,该融合蛋白能自然形成二聚体结构;可抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用,其中和5×104U/LTNF-α的EC50为170μg/L。FACE分析融合蛋白N-糖链的大小为11~13个糖残基。结论:在毕赤酵母菌中成功地表达了sTNFR II-IgG Fc融合蛋白,为在毕赤酵母菌中表达其他的Fc融合蛋白和抗体提供了参考。     

重组人胸腺素α原的制备及理化鉴定

目的建立rhproTα中试工艺并对rhproTα的理化性质和生物学活性进行鉴定。方法通过对培养条件的研究,建立了发酵培养工艺;通过对表达产物用酸沉、酚抽以及离子交换层析和反相层析等方法进行纯化;通过一系列分析方法对rhproTα的理化性质及生物活性进行鉴定。结果该因子在大肠杆菌中的表达水平为20%左右,纯度达到95%以上,测定其相对分子质量为11790、等电点为3.50,其N端序列、氨基酸组成、紫外分析等理化性质与理论值一致并具有较好的生物学活性。结论建立了rhproTα的中试工艺,完成了rhproTα的理化性质鉴定和生物活性测定,将有望进一步开发用于临床。     

EBOV三聚体糖蛋白在新型糖基工程酵母中的表达与纯化

目的 用新型糖基工程酵母表达并纯化得到具有类似哺乳动物细胞糖基化修饰的埃博拉病毒三聚体糖蛋白(EBOV-GP),为其亚单位疫苗研究提供基础.方法 人工合成EBOV-GP基因,将编码全长EBOV-GP基因和编码缺失黏蛋白样域(MLD)与穿膜区的EBOV-GPΔMLDΔTM基因分别克隆到pPICZ-αA载体上,电转化糖基工程酵母,与在HEK-293T细胞中表达的EBOV-GP进行比较,利用PNGaseF和EndoH酶切分析其糖基化修饰,利用亲和层析与离子交换层析纯化目的蛋白,蛋白质N端测序分析其在蛋白翻译修饰过程中是否正确切除了信号肽,同时利用凝胶柱分析是否能形成三聚体结构.结果 PNGaseF酶切结果显示,用糖基工程酵母和HEK-293T细胞表达的EBOV-GP糖蛋白相对分子质量大小与N-糖基化程度均一致,EndoH酶切显示EBOV-GPΔMLDΔTM的N-糖基化修饰是非高甘露糖形式的复杂型糖基化修饰;经三步纯化得到的目的蛋白,N端测序显示为GP蛋白成熟肽序列,其自身信号肽被正确切除;凝胶柱分析显示纯化得到的目的蛋白以三聚体形式存在.结论 用糖基工程酵母表达制备了具有复杂型糖基化修饰的EBOV-GP.     

H7 N9流感病毒血凝素HA在毕赤酵母中的表达及免疫原性分析

目的：利用毕赤酵母表达制备H7N9流感病毒血凝素[HA 1～525个氨基酸（aa）],并对其免疫原性进行研究。方法经全基因合成获得H7N9流感病毒[A／Hangzhou／1／2013（H7N9）]全长HA,以其为模板,PCR得到片段HA1－525,通过NspⅤ和NotⅠ双酶切连入pPICZαA载体,转入毕赤酵母X33,ELISA筛选阳性克隆。发酵培养后,表达上清经PEG20000沉淀获取HA1－525,并用糖苷内切酶H（ endo H）酶切分析其N-糖链。将制备的HA1－525免疫BALB／c小鼠,经ELISA检测特异性HA7抗体滴度,红细胞凝集抑制实验分析血抑活性。结果培养上清用抗HA7抗体经ELISA检测,重组菌成功表达HA7,且Western印迹检测发现有特异性弥散条带,经endo H 酶切后, HA1－525为均一条带,相对分子质量约58×103,与理论大小相当,表明HA1－525存在甘露糖基化结构。 HA1－525两次免疫小鼠后可产生1∶36000的抗体滴度。以H7N9裂解苗为抗原,检测其血抑活性为1∶700。结论利用毕赤酵母表达的H7N9流感病毒HA1－525可以诱导小鼠产生针对HA7的中和抗体。