原发性肝癌患者血清和肝组织中庚型肝炎病毒基因的PCR检测

用逆转录－聚合酶链反应法（ＲＴ－ＰＣＲ）检测了原发性肝癌（ＰＬＣ）患者血清及肝癌和癌旁肝组织中的庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）ＲＮＡ，以ＰＣＲ－双脱氧末端终止法测定了ＰＣＲ产物的核苷酸序列。结果显示，血清和肝组织中ＨＧＶＲＮＡ的检出率分别为１９．４％（１３／６７）和２５．７％（９／３５），且ＨＧＶＲＮＡ在肝癌组织呼吕旁肝组织中同时存在，血清和肝组织中ＨＧＶ ＲＮＡ检测结果的符合率为８５％；５′非编码区（５     

细胞凋亡的MTT染色法检测

目的研究MTT染色法用于检测细胞凋亡的可行性。方法以As2O3诱导K562细胞建立凋亡细胞模型,并比较以下3种方法检测凋亡的结果。MTT染色法检测、直接在光镜下进行形态学观察以及DNA凝胶电泳。结果MTT染色法可准确判定细胞凋亡,并可清晰分辨正常细胞、凋亡细胞和死亡细胞。结论MTT染色法是一种简单、可行的检测细胞凋亡的方法。     

用RD-PCR技术获取IL-1β作用前后NIT-1细胞的差异表达基因

目的：获取IL-1β作用前后NIT-1细胞的差异表达基因，为进行差异基因的克隆和鉴定奠定基础。方法：利用转基因小鼠胰岛β细胞系(NIT-1)，通过应用一种改良的筛选差异基因的技术(Restriction diSplay PCR，RD-PCR技术)筛选cDNA的差异表达条带。结果：通过对比对照组与实验组凝胶电泳结果，找出79条表达有差异的奈带，包括实验组出现的新条带和实验组缺失的条带。结论：应用RD-PCR技术成功分离了IL-1β作用前后NIT-1细胞的差异表达条带，为大量筛选、克隆与鉴定与B细胞破坏机制相关的新基因奠定基础．有助于了解胰岛素依粕型耱尿病(IDDM）发病的分子机制。     

血管内皮生长因子对人骨髓基质细胞增殖的影响及其形态学观察

目的 了解血管内皮生长因子(VEGF)基因对体外生长的人骨髓基质干细胞(hBMSCs)增殖以及组织学形态的影响. 方法 实验用骨髓取自早产死胎,采用全骨髓法培养.原代培养至第8～10天后传代培养.实验分为三组:VEGF和绿色荧光蛋白(GFP)基因转染hBMSCs组、空腺病毒载体转染hBMSCs组以及空白hBMSCs组.相差显微镜和光镜下进行HE染色组织学观察细胞生长形态变化.进行MTT检测.流式细胞仪分析细胞周期. 结果 倒置相差显微镜和HE染色后光镜下观察,三组细胞外形无明显差异,形态基本一致.随培养时间的延长,各组细胞数量都有所增加,各时间点经VEGF基因转染的hBMSCs吸光度值差异无统计学意义(P>0.05).转染VEGF基因的hBMSCs与转染空载体、未转染的hBMSCs相比较,DNA合成前期细胞所占百分比差异无统计学意义,反应增殖活力的增殖指数PrI(包括DNA合成期、DNA合成后期和有丝分裂期)差异无统计学意义(P>0.05).结论 转染VEGF对hBMsCs体外增殖和形态无明显影响.     

10例庚型肝炎病毒检测分析

１０例庚型肝炎病毒检测分析１５３医院传染科（河南郑州４５００６５）王全楚申德林张成道第二军医大学微生物教研室崔晓红宋艳斌戚中田我们对近３年来收治的３１例非甲非乙非丙非丁非戊型肝炎患者进行ＰＣＲ检测，发现１０例庚型肝炎病毒ＧＢＶ—ＣＲＮＡ阳性。现报告如...     

原发性肝癌78例血清HCVRNA和抗HCV的观察

用逆转录－聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验检测了７８例原发性肝癌患者清丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ、抗ＨＣＶ和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）免疫学标物。     

细胞松弛素B对K562细胞脱核作用的观察

目的观察细胞松弛素B(cytochalasin B, CB)对K562细胞形态和增殖能力的影响。方法以人红白血病K562细胞为细胞模型,经不同浓度的CB作用不同时间(4~48 h),通过相差显微镜和Giemsa染色观察细胞形态学改变。细胞计数法绘制细胞不同条件下的生长曲线。结果细胞形态发生显著变化,处理组细胞出现不同程度的脱核,细胞生长受到显著抑制。结论CB对K562细胞的脱核作用与其浓度呈正相关,随作用时间延长而增强;秋水仙素有显著提高CB诱发细胞脱核的作用;CB对细胞的增殖能力有显著抑制作用。     

细菌内重组法快速构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体

背景:腺病毒载体具有在哺乳动物及其多种细胞基因转移和蛋白表达的高效性,目前以细菌内重组法构建病毒载体成为常用方法.目的:观察以细菌内重组法构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体的可行性.设计、时间及地点:基因转染病毒载体的单一样本实验,于2007-10/2008-02在中山大学分子生物实验室完成.材料:合成血管内皮生长因子165基因的引物合成和序列测定由上海生工公司提供.pDNR-1r质粒(已含有绿色荧光蛋白基因)、pint.AV.spaT质粒、pint.B.B质粒均购自广州拓普基因技术公司.方法:通过动态模板PCR基因合成法合成的血管内皮生长因子165基因克隆入pMD18-T载体获得pMD18-T-VEGF165.将pMD18-T-VEGF165和pDNR经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,构建pDNR-VEGF165载体,酶切鉴定后,pDNR-VEGF165与pint.AV1.spat共转化BNN菌株的感受态细胞,构建pint,AV1.spat.VEGF165腺病毒表达载体,将线性化的pint.AV1.SpaT-VEGF165和pint.B.B转染293细胞.主要观察指标:以DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的感染效率.结果:重组质粒用EcoR Ⅰ酶切后,切成2条片段,大小约为1 kb和6.9 kb,实际的酶切分析结果与理论分析相符,证明转化子中的重组质粒为Cre-LoxP系统介导的含有血管内皮生长因子165基因的重组质粒.荧光显微镜下,8 h后即可见部分细胞发出荧光,24 h发荧光的细胞数及强度达到高峰,转染率超过80%.线性化的pint.AV1.SpaT-VEGF165和pint.B.B共转染293细胞,12-14 d后会出现细胞病变效应.分别提取病变293细胞、正常293细胞的DNA,PCR后,1%琼脂糖凝胶电泳,病变的293细胞在约500 bp处出现条带.结论:以细菌内重组法获得了含有成熟血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒.     

SARS冠状病毒检测60 mer寡核苷酸基因芯片的设计及应用

目的设计并应用60 mer寡核苷酸基因芯片实现对SARS冠状病毒的检测.方法根据寡核苷酸基因芯片的设计原则设计出30条60 mer的寡核苷酸片段,覆盖SARS冠状病毒(以TOR2株为参考序列,GENEBANK索取号:AY274119)全基因组,点样制备成12×12的寡核苷酸基因芯片,将临床诊断SARS患者痰液标本抽提病毒RNA,采用限制性显示技术进行标记,将标记好的样品与芯片杂交,洗脱,扫描.初步探索寡核苷酸芯片诊断SARS冠状病毒的敏感性及特异性,并对芯片做进一步的优化.结果来自SARS患者样品与芯片上的多个SARS探针杂交,出现了明显的荧光信号;阴性和空白对照探针上没有杂交信号,而对照样品仅与一个SARS探针有杂交.结论采用60 mer寡核苷酸基因芯片可以从基因水平实现对SARS冠状病毒多段序列的平行检测,对于提高检出率有一定意义,此外,尚可用于监测在发病过程的各个阶段中病毒基因的活动状况.