红白血病K562细胞基因表达谱芯片制作研究

以人红白血病K562细胞为材料，应用限制性显示PCR（RD-PCR）技术分离到K562细胞在诱导分化药物羟基脲诱导分化前后不同时期的cDNA片段3256条，并用DNA芯片仪制作了K562细胞基因表达谱芯片。对芯片制作中不同点样液及处理条件对玻片上DNA固定效率的影响，样品DNA最优浓度等进行了初步研究，结果认为用DMSO作点样液、样品DNA浓度为0.3μg/μL、点样后经紫外交联（150mJ）、80℃干烤2h,DNA探针在玻片上的固定效率可达95%。用此法制作的K562基因表达谱芯片得到较好的杂交效果。     

As2O3处理前后K562细胞基因表达变化的基因芯片检测

目的应用基因芯片研究三氧化二砷(As2O3)处理前后K562细胞基因表达的变化.方法提取As2O3处理前后K562细胞的总RNA,纯化为mRNA后再反转录为cDNA.cDNA经限制性内切酶Sau3AI切割后,cDNA片段分别用Cy3和Cy5标记,与自制的包含348个基因片段的胎盘库芯片杂交.结果杂交结果经扫描和软件分析,发现了11个差异表达的基因片段,其中有3个基因片段与细胞凋亡密切相关.结论我们构建的胎盘库基因芯片可以成功地用于研究药物作用前后基因表达的变化.     

RNAi技术沉默K562细胞中c-myc基因的初步研究

目的 运用RNAi技术,设计针对c-myc的小干扰RNA(siRNA),研究其干扰效果。方法 针对c-mycmRNA的第1357靶位点设计siRNAs,经Lipofectamine^TM2000脂质体法转染K562细胞,进行RT-PCR、细胞计数和MTT法及流式细胞仪检测,观察其干扰效果。结果 转染组与阴性对照组和空白对照组相比,c-mycmRNA表达明显减弱,细胞计数和MTTD(λ)值均有显著降低,并有明显的凋亡率。结论 运用RNAi技术,可以有效地干扰c-myc的表达,并进一步诱导细胞凋亡。     

bcr-abl基因沉默对相关基因表达的影响

目的运用RNAi技术,研究使bcr-abl基因沉默后相关基因表达变化。方法针对bcr-abl基因的融合位点设计siRNAs,用脂质体法转染K562细胞,进行细胞计数及流式细胞仪检测,观察干扰效果,应用RT-PCR检测相关基因表达变化。结果转染组与对照组相比,细胞数减少,有明显的细胞凋亡,bcr-abl,N-ras,c-myc基因的mRNA表达量降低。结论运用RNAi技术,可以有效地诱导细胞凋亡,抑制相关基因的表达,为研究CML的发生机制奠定基础。     

SARS冠状病毒N基因的扩增与克隆

目的RT-PCR扩增、克隆SARS冠状病毒N蛋白基因。方法根据GenBank数据库中TOR2株的全基因组序列,利用Primer Premier 5.0软件设计引物RT-PCR巢式扩增SARS冠状病毒的N基因,PCR产物克隆后进行测序鉴定。结果序列分析表明,pMD18-T载体中已成功重组了N基因。结论N蛋白基因的扩增、克隆成功,为N蛋白的表达、N蛋白结构与功能的研究奠定了基础。     

DNA芯片技术筛选K562肿瘤细胞特异性基因

目的应用DNA芯片技术筛选人白血病K562细胞中的肿瘤特异性基因。方法提取正常人白细胞和K562细胞基因组DNA,并用限制性内切酶Sau3AI酶切。其中K562细胞基因组酶切产物经DNA聚合酶Ⅰ补平加A后克隆到T-载体,挑选阳性克隆,用PCR扩增,以纯化的PCR产物做探针,制备K562细胞基因组DNA芯片。正常人白细胞基因组酶切产物加上人工通用接头,用限制性标记技术标记上荧光标记物Cy3,与制备的K562细胞基因组DNA芯片杂交。结果芯片杂交结果经扫描分析,发现42个K562细胞肿瘤特异性基因,进一步用序列分析证实,其中有1个为BCR(breakpoint cluster gene)基因。结论我们自制的K562细胞基因组DNA芯片可以成功地用于筛选肿瘤特异性基因,为更好地从基因组水平研究肿瘤发生的分子机制提供了新的技术途径。     

应用70 mer Oligo基因芯片从限制性cDNA片段中钓取目的基因

目的 探讨采用单一探针寡核苷酸阵列从经限制性显示方法制备的cDNA片段中钓取目的基因片段的方法。方法酵母经常规培养,抽提mRNA逆转录成cDNA后,经限制性显示技术制备成限制性cDNA片段,根据目的基因SSA1设计70mer特异性oligo片段并打印成为寡核苷酸阵列。采用荧光标记的通用引物对上述经限制性显示技术获得的限制性cDNA片段进行标记,与oligo阵列杂交,洗脱,扫描。然后进行杂交后剥除,收集剥除液,采用限制性通用引物扩增,产物克隆于PUC18T载体中,并转化至JM109大肠杆菌中培养,抽提质粒,进行测序鉴定。结果 测序结果BLAST同源性比较表明,用该方法成功的克隆出了目的基因片段。结论 采用70mer寡核苷酸芯片可以直接从限制性显示方法处理的cDNA片段中钓取目的基因,而无需构建cDNA文库。另外,本方法也可用于oligo芯片的杂交后对有表达差异的基因的获取及研究中。     

细胞周期蛋白依赖性激酶-2两种剪接体在SH-SY5Y细胞中共表达

目的观察细胞周期蛋白依赖性激酶-2(CDK-2)在SH-SY5Y细胞中的表达情况。方法采用RT-PCR方法研究CDK-2的表达,用DNA银染技术观察PCR产物,割胶回收后,克隆到载体上、测序。结果在聚丙烯酰胺胶上可以观察到两条DNA带,相对分子质量小的DNA带染色较弱;将两条DNA带切下,回收后与载体连接,测序证实两条DNA带均为CDK-2基因的产物。结论CDK-2的两种剪接形式在SH-SY5Y细胞中共表达,其中一种剪接形式是第五外显子缺如,但其表达量比较弱,其作用机制仍有待于进一步研究。     

活细胞计数试剂盒在检测5-氮杂-2’-脱氧胞苷对慢性粒细胞白血病细胞的增殖抑制作用中的应用

目的探讨活细胞计数试剂盒(CCK-8)在检测5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-dc)对慢性粒细胞白血病细胞的增殖抑制作用中的应用。方法采用CCK-8检测不同浓度5-Aza-2’-dc对K562细胞的增殖抑制作用,并检测其半数抑制浓度对K562细胞的细胞周期和凋亡的影响。结果 5-Aza-2’-dc的半数抑制浓度为15.55nmol/L,采用该浓度处理K562细胞后,G2期发生阻滞,增殖抑制,并出现凋亡峰。结论不同浓度的5-Aza-2’-dc对K562细胞增殖的抑制作用不同,且呈浓度依赖关系。CCK-8检测法可运用于甲基化转移酶抑制剂对人慢性粒细胞白血病细胞增殖的影响。     

hsa—miR-30e的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的克隆hsa—miR-30e并构建其慢病毒表达载体。方法PCR扩增hsa—miR-30e的前体序列,克隆于慢病毒载体p113．7,转染包装细胞293FT细胞,收获病毒颗粒,荧光定量PCR检测hsa—miR-30e的表达。结果经双酶切及测序鉴定,hsa—miR-30e的慢病毒表达载体构建成功,倒置荧光显微镜下观察转染后293FT细胞发出绿色荧光。结论成功构建hsa—miR-30e的慢病毒表达载体,为进一步研究hsa-miR-30e的生物学功能奠定了基础。