HCV NS5A-B片段的表达及在酶活性研究中的应用

目的：利用原核表达载体pBVIL1，表达丙型肝炎病毒非结构蛋白（NS3）丝氨酸蛋白酶催化底物NS5A—B小分子，为进一步研究蛋白酶活性提供方法学。方法：将PCR合成的NS5A—B（2412—2427aa）基因直接插入高效原核表达载体pBVIL1，融合表达NS5A—B片段．包涵体形式的表达产物用8mol／L脲溶解后，采用离子交换和凝胶过滤两步纯化。利用SDS—PAGE、Western blot和ELISA方法，于37℃酶催化条件下，分析NS5A—B底物的降解活性。结果：（1）构建了pBVIL1／NS5A—B重组质粒，鉴定证明NS5A—B基因片段正确地插入表达载体上：融合蛋白在转化质粒的HB101菌中得到高效表达。分离纯化重组蛋白后浓度可达0．73g／L。（2）在NS3蛋白酶作用不同时间后，用SDS—PAGE和Western blot证实，底物带可被明显降解，ELISA分析也证明，NS5A—B具有酶底物活性。结论：含有酶切位点的NS5A—B融合蛋白可被NS3丝氦酸蛋白酶有效地降解，可用作为NS3蛋白酶的底物，可替代全长NS5A—B和化学合成肽用于酶活性和酶阻断剂的研究     

丙型肝炎病毒第一高变区代表序列重组肽的交叉性研究

目的：研究丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）第一高变区（hypervariable region 1,HVR1）抗原的交叉反应性，获得适合我国HCV感染株的高交叉反应性HVR1y序列及其组合。方法：对我国报道的HVR1序列，用计算机进行同源性分析，从中选出可能具有高交叉反应的HVR1序列，也选择文献报道的具有高交叉反应性的HVR1序列或HVR1模拟肽序列。用合成基因及重组表达技术，获得一系列重组HVR1肽，并用间接ELISA法研究这些重组HVR1对我国HCV阳性血清的交叉反应性。结果与结论：本研究获得了12条重组HVR1肽抗源，用随机选择的27份我国HCV阳性血清进行交叉反应性检测，发现每条重组HVR1均和不止一份的阳性血清有反应。选择其中4条适合我国的交叉反应性较好的重组HVR1，其交叉反应率可覆盖27份阳性血清的25份（92.5％），对解决HCV疫苗研究中存在的变异问题具有重要意义。     

丙型肝炎病毒T细胞表位的筛选及其在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)不同变异株中，筛选高保守的能涵盖多种MHC限制类型的T细胞表位，并构建重组表位抗原的原核表达质粒。方法：检索文献并结合MHC限制型，从中遴选出功能明确的T细胞表位；利用Goldkey软件，建立HCV全长蛋白序列数据库；从中分别截取各个表位所在区段，对所选取的表位进行同源性比较；从中选取保守性强的部分表位，用化学法合成表位基因，插入原核表达载体pBVIL1中，构建多个融合表达质粒并在E．coli表达。结果：从文献中获得HCV免疫优势性T细胞表位18个，在由55条全长HCV序列组成的数据库中进行比较，获得了大量有关表位保守性的信息，并进行了统计分析，所构建的5个表达质粒pBVIL1—T1—T5经鉴定后，在大肠杆菌中均获得了高效表达。结论：本研究有助于深入认识HCV T细胞表位的特性，为表位的筛选提供了方法学依据，所选取的表位及原核表达的重组蛋白，为HCV治疗性疫苗的实验研究提供了候选抗原。     

HCV核心蛋白C末端片段在大肠杆菌中的表达及抗原性分析

[目的]构建含HCV核心蛋白近C端片段的原核表达载体，纯化融合蛋白，探讨表达产物的抗原性。[方法]PCR扩增HCV核心蛋白近C端片段基因，克隆入原核表达载体pGEX-4T-2，诱导表达、提取包涵体纯化日的蛋白；ELISA分析该融合蛋门的抗原性。[结果]正确构建HCV核心蛋白片段基因的原核表达质粒，目的蛋白质在大肠杆菌中获到高效表达，并得到有效纯化；ELSA结果显示该融合蛋白具有良好的抗原性。[结论]该HCVC融合蛋白检测HCV感染患者血清具有良好的特异性和敏感性，可望提高HCV抗体检测试剂盒的检出率。     

核心链霉亲和素基因的克隆及其在大肠埃希氏菌中的表达

目的 克隆、表达核心链霉亲和素(core-strepavidin,core-SA)基因.方法 人工合成核心链霉亲和素基因;克隆到pET22b原核表达载体中,转化大肠埃希氏菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析;目的 蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化,采用改良过碘酸钠法标记HRP,ELISA法检测比较HRP-SA与商品化HRP-SA的活性.结果 人工合成的354bp DNA片段经测序确证为核心链霉亲和素基因.将构建的重组表达质粒pET 22b-core SA转化大肠埃希氏菌BL21,经IPTG诱导后得到可溶性的表达产物.SDS-PAGE显示目的 蛋白相对分子质量为14 000,与理论值相符.在非变性条件下纯化目的 蛋白,经HRP标记后用ELISA法检测,结果 表明自制的HRP-SA与商品化HRP-SA的活性相当.结论 成功克隆和表达了核心链霉亲和素基因.     

人乳腺珠蛋白单克隆抗体制备及生物特性鉴定

目的构建重组hMAM蛋白,通过杂交瘤技术获得特异性的抗hMAM的单克隆抗体,并鉴定其生物特性。方法克隆表达hMAM 8-93AA、20-52AA、43-70AA、56-82AA、67-93AA区段的抗原,以纯化的pBV220/hMAM(8-93AA)为免疫原,杂交瘤技术筛选出能稳定分泌抗hMAM单克隆抗体的细胞株。采用Western blotting和免疫组织化学染色方法鉴定其表位和特异性。结果获得6个高纯度的重组抗原,通过pBV220/hMAM(8-93AA)免疫小鼠后,获得2株稳定分泌抗hMAM抗体的杂交瘤细胞株。Western blotting结果显示MAb1、MAb2分别是识别hMAM20-52AA、hMAM52-67AA片段的特异性单克隆抗体。免疫组织化学染色结果显示该抗体仅在乳腺组织中呈阳性反应,在其他肿瘤组织中不反应。结论通过杂交瘤技术成功制备了两株稳定分泌且高特异性的抗hMAM不同位点的单克隆抗体细胞株,为进一步研制高灵敏的乳腺癌早期检测试剂奠定了基础。     

人羧基肽酶H不同区段抗原的克隆表达及其初步应用

目的 构建人羧基肽酶H不同区段抗原的原核表达载体,诱导表达获得重组蛋白,初步验证人羧基肽酶H不同抗原区段在羧基肽酶H自身抗体检测中的应用价值。方法 应用RT-PCR方法调取目的基因,构建相应的原核表达质粒,转化大肠埃希氏菌诱导表达重组蛋白,用重组蛋白作为包被抗原建立人羧基肽酶H自身抗体的间接ELISA方法,评价羧基肽酶H抗原在检测新诊断2型糖尿病患者抗羧基肽酶H自身抗体中的应用价值。结果 获得了羧基肽酶H三种不同区段抗原,其中42～476氨基酸区段为较理想的抗原。以该全长抗原作为包被抗原检测95例新诊断2型糖尿病患者,羧基肽酶H自身抗体阳性率为8.42%。结论 原核克隆表达的人羧基肽酶H 42～476氨基酸区段抗原具有良好的抗原性,可作为成人隐匿性自身免疫性糖尿病鉴别诊断的候选抗原。     

甲型H1N1流感病毒抗原表位区段的克隆和表达

据统计,全世界每年流感流行都会造成10％～20％的人感染流感病毒,给整个社会带来极大的经济负担。2009年4月在墨西哥、美国暴发的甲型H1N1流感,其病毒是一种与猪流感病毒高度同源的新型变异毒株,它包含禽流感、猪流感和人流感3种流感病毒的基因片段,同时拥有亚洲猪流感病毒和非洲猪流感病毒的特征,是一种“杂交型”流感病毒。与传统的猪流感病毒不同,该病毒能在人和人之间快速传播。到目前为止,全球40多个国家均发现有甲型H1N1流感病毒感染的存在,国内外高度关注该病毒诊断试剂和疫苗的研制。     

抗结核分枝杆菌抗原优势肽段单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的:制备和初步鉴定抗结核分枝杆菌抗原优势肽段的单克隆抗体。方法:以两种优势肽段的融合抗原PGEX-4T-2/38kD-ESAT6-CFP10和PGEX-4T-2/Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合后,通过有限稀释法筛选阳性克隆,经ELISA和Western blotting分析单抗的特性和特异性。结果:获得17株结核分枝杆菌抗原优势肽段特异单克隆抗体杂交瘤细胞株,经间接ELISA方法测定,杂交瘤细胞培养上清效价为28～212,接种小鼠的腹水效价为216～220。Western blotting结果显示,每株单抗均能特异性的识别融合蛋白的优势肽段。结论:制备了针对抗结核分枝杆菌抗原优势肽段的单克隆抗体,为结核分枝杆菌的快速诊断和抗原性分析奠定了基础。     

稳定表达人MAGE-1基因的小鼠细胞系的建立与鉴定

目的：克隆人黑素瘤抗原-1（MAGE-1）基因，构建真核表达载体，建立稳定表达人MAGE-1的小鼠细胞株。方法：提取人肝癌细胞的总RNA，RT-PCR法获得人MAGE-1cDNA，将测序正确的MAGE-1基因克隆至真核表达载体pcDNA3中，进行酶切鉴定和序列测定。将重组质粒pcDNA／MAGE和空载体pcDNA3分别转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2／0中，经G418筛选获得稳定表达株，用RT-PCR和Western印迹检测MAGE-1基因的转录及蛋白表达。结果：从肝癌细胞中成功克隆到人MAGE-1基因，经测序证明基因正确，酶切和序列测定表明，人MAGE-1基因的真核表达质粒已成功构建。将此重组质粒转入的SP2／0细胞可稳定表达人MAGE-1基因。结论：成功构建可稳定表达人MAGE-1基因的小鼠转基因细胞，为MAGE-1的免疫治疗研究奠定了基础。