可溶性嵌合补体抑制分子的构建及表达

目的：制备能抑制补体活化的2个关键环节（C3/C5转化酶和MAC的形成）的一种新型、高效补体抑制剂。方法：先设计引物，然后通过PCR技术扩增重组可溶性CD46/CD55/CD59嵌合分子cDNA片段，重组于pSecTagA真核表达载体上，分别利用COS-7细胞和中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞进行表达，并用抗人CD46多克隆抗体及抗人CD55、CD59单克隆抗体对表达产物进行western bolting鉴定。结果：DNA测序证实，前端带有小鼠IgGκ链前导序列，后端融合有编码6个组氨酸碱基的CD46/CD55/CD59嵌合分子cDNA片段的阅读框完整。免疫印迹结果显示，表达的重组蛋白分别能与抗人CD46多克隆抗体和抗人CD55、CD59单克隆抗体结合。结论：成功构建并在真核细胞内表达了重组可溶性CD46/CD55/CD59嵌合分子，为进一步研制和开发新一代多功能、多靶点补体抑制剂奠定了基础。     

人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆及其真核表达的研究

目的　克隆获得编码人补体膜辅助调节蛋白（ ＭＣＰ） 的ｃＤＮＡ,并对其在真核细胞的表达及功能进行研究。方法　应用ＲＴＰＣＲ 方法,从Ｕ９３７ 细胞总ＲＮＡ 中扩增编码人ＭＣＰ 分子的ｃＤＮＡ片段, 快速克隆于ｐＧＥＭＴＥａｓｙ 载体,测定其序列。将该片段重组于ｐＬＸＳＮ 载体,电穿孔转染ＮＩＨ３Ｔ３ 细胞,经ＦＡＣＳ 检测筛选表达ＭＣＰ 的阳性细胞克隆,用补体溶破试验鉴定其抑制人补体溶破的功能。结果　ＲＴＰＣＲ 扩增得到１ １４４ｂｐ 的编码人ＭＣＰ 分子的ｃＤＮＡ 片段,序列分析表明该ｃＤＮＡ编码的蛋白为ＳＴＣ＋ ＣＹＴ２ 亚型。细胞转染筛选获得多个表达ＭＣＰ 的ＮＩＨ３Ｔ３ 阳性细胞克隆,补体溶破试验证实其具有抑制人补体经典途径和旁路途径溶破的功能。结论　本研究为进一步探讨不同亚型结构的ＭＣＰ 分子与功能的关系及其应用奠定了基础。     

BTLA蛋白胞外区片段的制备及鉴定

目的克隆人的BTLA蛋白分子的基因胞外区片段(Extracellular region of BTLA，exBTLA)，并在Flp-In CHO系统表达、纯化，用于单克隆抗体的制备或直接进行功能研究。方法用RT-PCR方法制备exBTLA基因，以哺乳细胞高效表达质粒载体pSec／WG为载体构建重组融合exBTLA-Ig Fe／pSec／WG质粒。重组体经双酶切鉴定后，再通过测序鉴定克隆的正确性。采用脂质体法将重组质粒转染Flp-In CHO细胞，G蛋白亲和层析法纯化蛋白。用Western blotting检测BTLA基因胞外区表达的特异性。结果正确构建了exBTLA／pSec／WG重组质粒，并在转染细胞所分泌的上清液中检测出了蛋白片段的表达。利用亲和层析法成功纯化出特异的exBTLA蛋白。结论成功地构建了exBTLA／pSec／WG重组质粒，纯化出exBTLA蛋白，为下一步mAb制备及其功能研究提供实验依据。     

中和性马抗体对SARS-CoV感染的防治作用

目的探讨马抗SARSCoV中和性抗体是否对SARSCoV感染有防治作用。方法用SARSCoV(BJ01株)免疫马匹,从免疫马血清中制备IgGs及其F(ab’)2片段。通过细胞病变法(CPE)、MTT法和空斑形成实验(PFU)等方法,在体外培养的VeroE6细胞中检测F(ab’)2片段对SARSCoV感染的预防性和治疗性作用。再在Balb/c小鼠体内模型中,用CPE法和定量RTPCR方法检测该抗体的保护性效应。结果CPE、MTT和PFU三种方法证实来自三匹马的血清F(ab’)2的中和滴度均达到1∶1600以上。体内实验证实,50μg的F(ab’)2片段可以完全中和1×104TCID50SARSCoV。结论马抗SARSCoV抗体在体内外均能有效地中和SARSCoV和预防其感染宿主细胞,为马抗体将来在大的灵长类动物或人体内进行实验提供实验依据。