肝细胞核因子-4与MODY

肝细胞核因子 4(HNF 4)是高度保守的孤受体家族成员之一。载脂蛋白、α1抗胰蛋白酶、丙酮酸激酶和红细胞生成素等编码基因启动子中均含有HNF 4反应元件。HNF 4可与其他HNF分子共同组成HNFs转录因子调节网络 ,并可与HNF 4反应元件作用 ,进而调节组织分化、糖及脂类等能量物质的代谢。HNF 4的突变型可诱发青少年发病型成人糖尿病 (MODY)。对HNF 4α的无义突变型HNF 4.Q2 6 8X和HNF 4.E2 76Q的研究揭示出MODY形成的分子机制 ,为MODY的基因治疗奠定了理论基础。     

兔抗人ERA抗血清的制备

目的 在大肠杆菌中表达人ERA蛋白（h-ERA)和h-ERAC端结构域蛋白。并制备兔抗h-ERA抗血清。方法 以PCR扩增人era基因（h-era)全长cDNA和h-ERAC端的结构域基因,并分别克隆到（His)6融合表达载体RSET-C和非融合表达载体pDH中,诱导表达（His)6-h-ERA融合蛋白和h-ERAC端结构域蛋白,用h-ERAC端结构域蛋白免疫兔,制备兔抗h-ERA抗血清,并以Western-blot对兔抗h-ERA抗血清进行鉴定。结果 大肠杆菌中表达的h-ERAC端结构域蛋白和（His)6-h-ERA融合蛋白,分别占菌体总蛋白的40%和80%。用兔抗血清可检出大肠杆菌中表达的（His)6-h-ERA融合蛋白。结论 h-ERA和h-ERAC端结构域蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,并成功地制备了兔抗h-ERA抗血清。     

小鼠ERA蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的:对小鼠ERA蛋白(mERA)进行表达、纯化,为真核生物ERA功能研究奠定基础.方法:构建MBP-mERA融合表达载体.在大肠杆菌中诱导表达融合的小鼠ERA蛋白,经直链淀粉亲和层析纯化,Western Blotting鉴定所表达纯化的蛋白.结果:表达的MBP-mERA融合蛋白占菌体总蛋白的18 %;纯化后的融合蛋白纯度为70 %;Western Blotting证实了mERA蛋白的表达.结论:利用基因重组技术,在大肠杆菌中高表达了mera基因,并对融合蛋白进行了初步纯化.     

人bit1 cDNA基因的克隆、测序及表达

目的: 克隆并在大肠杆菌中表达人bit1 cDNA基因. 方法: 从新鲜的胎盘组织中提取总RNA,经反转录成单链cDNA, 以此为模板扩增出人bit1 cDNA基因,将该基因克隆入载体pUC19中,测序正确后亚克隆入表达载体pGEX-4T3中进行表达. 结果: 利用所设计的引物扩增出完整的人bit1 cDNA基因.以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得表达,激光薄层扫描显示表达蛋白占总蛋白的40.6%. 结论: 获得了人bit1 cDNA基因及其原核表达产物,对研究人Bit1蛋白的功能具有重要的意义.     

临床医学本科专业公共选修课《法医学》教学探讨

本教研室在临床医学本科专业公共选修课《法医学》教学过程中,从教学整体设置、案例和讨论式教学的有效实施、多媒体和网上课堂教学手段的充分运用、参观实践和师生座谈会的组织开展等方面进行了有益尝试,通过上述努力,提升了公共选修课《法医学》教学质量。     

6His-hEra融合蛋白的高效表达

目的 :在原核表达系统中对人Era基因进行表达。方法 :人era编码区基因克隆入pUC19质粒中 ,经全自动序列分析仪测序正确后 ,再克隆入表达载体pRSETB中 ,构建成融合 6个组氨酸的高效表达载体pRSETB Era ,转化大肠杆菌BL2 1DE3(plysS)诱导表达。结果 :经IPTG诱导后 4h ,SDS PAGE及凝胶密度扫描分析 ,表达出分子量约 4 1kD的蛋白 ,占菌体总蛋白的 5 1 2 %。结论 :该基因在大肠杆菌中的高效表达为人era的功能研究打下了基础。     

shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默

目的:构建用于RNAi的shRNA(small hairpin RNA)表达载体及检测其对低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF1)基因的沉默效果.方法:从人血基因组中PCR扩增出H1基因启动子,克隆入酶切处理后的pEGFP-C1载体片段中,此载体命名为pWH1.以人HIF1 cDNA基因为靶标设计引物,退火后克隆入pWH1.新的载体转染SGC7901细胞,然后用RT-PCR和Western blot检测HIF1基因的表达改变.结果:构建的pWH1载体能很好地表达针对HIF1基因的shRNA,RT-PCR和Western blot的结果显示HIF1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显下降.结论:成功构建了shRNA表达载体pWH1,这对于基因的功能研究具有重要的意义.     

抗角蛋白Fab抗体在大肠杆菌中的表达与复性研究

目的 :用大肠杆菌分别表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,体外复性得到Fab抗体。方法 :从已构建的质粒p3MH/Fab中 ,亚克隆抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段基因 ,并分别插入载体pET32a中 ,构建重组质粒。以重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下进行表达。SDS PAGE分析发现 ,在相对分子量 (Mr)为 2 5 0 0 0处有外源蛋白表达。轻链和Fd片段变性后等量混合于折叠液中 ,复性后形成Mr 约为4 5 0 0 0的蛋白。结果 :成功地表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,ELISA和Westernblot证实 ,复性产物具有与角蛋白结合的能力。结论 :获得了具有活性的抗角蛋白的Fab抗体 ,为其应用研究打下了基础 ,也表明包涵体表达基因工程抗体技术是可行的。     

人Era蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

目的 在大肠杆菌中对人era基因（简称hera)进行表达、纯化。方法 PCR扩增hera基因,测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-C,重组质粒pRSETC-hera以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌,用IPTG进行诱导表达。然后利用亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化。结果 克隆了hera基因,测序正确;利用pRSET-C载体在大肠杆菌中融合表达了全长hera-cDNA基因,表达量占细菌总蛋白的59．6％。融合蛋白在菌体内主要以包涵体形成存在,在变性条件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化此融合蛋白,其纯度达到了98．0％。结论 利用基因重组技术在大肠杆菌中高表达了hera基因。并对融合蛋白进行了初步纯化。     

小鼠内皮抑素基因的克隆及序列测定

目的 获取小鼠内皮抑素（endostatin)基因并进行序列测定,为今后研究其机制及应用创造条件。方法 以小鼠肝脏总RNA为模板,用RT-PCR法从中扩增endostatin基因,并将所得基因重组入pUC19载体质粒,采用自动测定仪及荧光素标记引物,测定目的基因序列。结果 从小鼠肝组织中成功扩增endostatin基因,莘成功克隆入pUC19载体。经酶切鉴定正确后,命名为pUC-Endo。经测序证实所获基因序列与已知的endostatin基因序列一致。结论 成功构建小鼠endo-statin基因的重组克隆pUC-Endo,为今后利用endostatin进行胶质瘤的抗血管生成治疗研究奠定了实验基础。