我国登革2型病毒43株基因组全长cDNA的构建

目的 构建我国登革2型病毒43株基因组全长cDNA,为进一步研究其体外RNA转录产物的感染性,阐明致病机理及探索新型疫苗奠定基础。方法 根据登革2型病毒参考株NGC株的核苷酸序列,利用DNASTAR软件设计覆盖登革2型病毒43株基因组的6对重叠引物。从感染登革2型病毒43株的乳鼠脑中提限病毒基因组RNA,采用RT－PCR分别扩增6条基因片段,并将其分别与pGEM－T载体进行连接。重组质粒用PCR进行快速鉴定,并在377A型自动测序仪进行序列分析。然后利用单一酶切位点,分别自阳性重组子上切下各基因片段,在体外分别进行5′半分子和3′半分子的连接,最后将5′和3′半分子连接成基因全长的cDNA。扩增各接头两侧长约457－691bp的基因片段,连接至T载体后测序,从而对全长cDNA进行鉴定。结果 共扩增出6条约1．5－2．5kb的基因自然,并在体外进行连接,获得了全长cDNA。结论 通过测序证实成功地构建了我国登革2型病毒43株基因组全长cDNA分子。本研究结果将为阐明我国登革病毒株的毒力及致病机理奠定基础。     

我国登革2、3、4型病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性研究

目的 研究我国登革2、3、4型病毒全长cDNA体外RNA转录体的感染性，为构建登革病毒的感染性克隆、深入阐明病毒的致病机理奠定基础。方法 以我国登革2、3、4型病毒基因组全长cDNA为模板，用SP6 RNA聚合酶系统制备体外RNA转录体，经电穿孔转染细胞，观察其致细胞病变效应。从病变细胞培养上清中提取总RNA，用病毒特异引物进行RT-PCR扩增，以证实细胞病变为转录体RNA的恢复病毒所致。结果 我国登革2、3、4型病毒全长cDNA的体外RNA转录体均可使细胞产生病变，从细胞培养上清中可扩增出登革病毒特异的片段。结论 构建的我国登革2、3、4型病毒全长cDNA的体外RNA转录体具有感染性．可在蚊传代细胞内恢复为登革病毒颗粒。     

实时RT-PCR检测甲型H3N2流感病毒R292K耐药位点

目的建立快速检测甲型H3N2流感病毒神经氨酸酶（NA）奥司他韦耐药突变位点的实时RT-PCR方法。方法通过设计特异性靶向NAR292K突变位点的Taq-MGB探针进行实时RT-PCR反应,并利用模拟样本和临床标本进行灵敏性和特异性评价。结果与结论建立了快速检测NAR292K位点的实时RT-PCR检测方法;本方法灵敏性高,可检测低至500拷贝/μl;特异性好,与无耐药突变的甲型H3N2流感病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,为流感耐药监测提供了有效工具。     

帕罗西汀合并认知行为疗法治疗惊恐障碍

目的观察帕罗西汀合并认知行为疗法对惊恐障碍的治疗效果。方法对符合CCMD-11～R诊断标准的28例惊恐障碍患者给每晨饭后20-40mg的帕罗西汀连续治疗6个月,同时给予认知行为治疗,按临床疗效判定标准定期评定。结果1个月显效者占21．4％,好转占64．3％,无效占14．3％;3个月显效者占71．4％,好转占28．6％,半年时显效者占85．7％,好转者占14．3％。21．4％患者在治疗中出现轻微的副作用,随时间延长而消失。结论帕罗西汀合并认知行为治疗能明显缩短疗程,减少医疗开支,安全性高,依从性好。     

西尼罗病毒Chin-01株基因组编码区序列测定及分析

目的：对保存的西尼罗病毒Chin-01株基因组编码区序列进行测定，了解其与已报道毒株的序列差异及系统进化关系。方法：对Chin-01株病毒基因组编码区分区段进行RT-PCR扩增，分别将扩增产物直接进行测序，采用DNAstar软件将测序片段拼接获得全长编码区序列。结果与结论：Chin-01株基因组编码区全长10302nt，为单一读码框架，编码3434个氨基酸。其中结构蛋白基因为2373nt，依次编码4种结构蛋白(C，PrM，M和E)；非结构蛋白基因全长7926nt，依次编码7种非结构蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。序列同源性分析表明，Chin-01株与埃及Eg101株高度同源，两者氨基酸序列仅有0．3％的差异。该株西尼罗病毒基因组编码区序列已输入GenBank数据库。     

免疫荧光法检测广州非典型肺炎患者血清

本文应用军事医学科学院微生物流行病研究所在国内首次从北京非典型肺炎患者中分离出的冠状病毒BJF株及从广州非典型肺炎患者中分离出的冠状病毒GZF株感染Vero E6细胞后制成的抗原片作为抗原 ,用间接免疫荧光法检测了 14例广州地区临床诊断为非典型肺炎患者的血清。结果显示 ,1     

痘苗病毒检测方法的建立

目的：建立痘苗病毒的检测方法。方法：采用细胞病变法观察痘苗病毒感染的HeLa细胞，通过电镜直接观察病毒颗粒的形态特征，观察鸡胚绒毛尿囊膜上形成的痘斑并用分子生物学方法分析痘苗病毒HA基因片段。结果与结论：痘苗病毒感染HeLa细胞34h后出现典型细胞病变。在病毒感染细胞47h后的培养上清和胞浆中均可通过电镜观察到病毒颗粒。感染的鸡胚绒毛尿囊膜上出现痘宽。进一步采用PCR法扩增病毒的HA基因，RFLP限制性内切酶片段多态性分析和序列测定证明该序列与已知序列一致。所建立的痘苗病毒系列检测方法。为天花相关病毒的实验室诊断奠定了基础。     

西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区（UTR）中复制相关元件的功能研究

目的研究西尼罗病毒Chin-01株5′非编码区(UTR)中复制相关元件的功能,为探讨该病毒基因组复制的分子机制提供理论依据。方法通过生物信息学分析,初步筛选出Chin-01株5′UTR中可能的复制相关位点,并构建相应的重组亚基因组突变体,然后以上此为模板,经体外RdRp活性分析及凝胶阻滞试验,观察NS5的RdRp活性及与突变体的结合能力,再将突变位点引入该病毒感染性全长cDNA克隆,初步观察突变体恢复病毒的生物学特性。结果5′UTR中第45-60位核苷酸缺失的突变体无法合成子链,与NS5的结合能力也显著降低。第8和9位核苷酸改变的突变体则丧失了合成子代RNA及与NS5的结合能力,第8、9、69和70位核苷酸突变后形成的结构恢复突变体则可以合成子链RNA,并可与NS5特异性结合。同时,第45-60位核苷酸缺失及第8和9位核苷酸突变的恢复病毒的增殖能力也显著降低。结论Chin-01株5′UTR中的第45-60位及第8、9、69和70位核苷酸维持的结构可能是该病毒基因组复制的关键位点。     

登革病毒衣壳蛋白与葡萄球菌核酸酶融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：实现登革病毒衣壳蛋白C与葡萄球菌核酸酶SN融合蛋白在大肠杆菌中的表达。方法：利用基因重组技术将通过BamHⅠ连接在一起的CSN基因克隆入表达载体pLEX，转化大肠杆茵G1724并以色氨酸诱导表达，用SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定表达的融合蛋白，采用TDA显色法检测融合蛋白中SN的活性。结果与结论：成功构建重组表达载体pLEX-CSN并在大肠杆菌中获得表达，表达的融合蛋白相对分子质量约27000，可被抗登革病毒C蛋白抗体识别，并具有SN的生物活性。为探讨登革病毒衣壳蛋白靶向性抗病毒作用奠定了基础。     

北京株和广州株SARS病毒与非典型肺炎患者血清中和抗体反应观察

目的 研究北京和广州地区分离的SARS病毒的抗原性关系，为非典型肺炎疫苗候选株的筛选提供依据。方法 采用Reed-Muench法测定BJ01和GZ01株病毒的滴度，分别选取北京和广州地区SARS病人血清各6份，采用固定病毒．稀释血清法进行微量细胞交叉中和试验，测定两地病人血清对BJ01和GZ01株病毒的中和抗体水平及交叉中和能力，分析这两株SARS病毒抗原性的差异。结果 北京和广州两地的非典型肺炎病人血清能够中和本地分离的SARS病毒。两地血清可互相交叉中和BJ01和GZ01株SARS病毒。中和抗体水平相同。结论 北京和广州两地分离的SARS病毒BJ01和GZ01株抗原性相似、差异较小。