利用RNAi技术抑制Bcl 2基因表达增强肺腺癌A549细胞放射敏感性

目的利用RNAi技术抑制Bcl 2基因的表达,观察其对肺腺癌A549细胞凋亡和放射敏感性变化的影响。方法构建Bcl 2基因的干扰质粒pBcl 2 siRNA,稳定转染人肺腺癌A549细胞,同时设立转染无意义链组、空载体组和未转染组。采用Real time RT PCR和Western blot方法, 观察Bcl 2基因在mRNA和蛋白水平表达的变化。采用流式细胞术和克隆形成方法,检测RNA干扰对A549细胞放射敏感性的影响。结果成功构建bcl 2 siRNA质粒,转染A549细胞,获得稳定转染细胞株A549/Bcl2 Ins;Bcl 2mRNA、 Bcl 2蛋白表达明显降低;A549/Bcl2 Ins凋亡率［（10.11±0.92）%］明显高于对照组,6Gy X线照射后凋亡率［（28.81±1.10）%］明显高于对照组及未照射组;A549/Bcl2 Ins的D0和Dq值分别为1.399和1.298,明显低于转染无意义序列细胞株A549/Bcl2 Neg(1.695和2.480)、转染空载体细胞株A549/SD (1.706和2.227)和空白对照细胞A549(1.816和2.777)。结论RNAi技术可以有效抑制肺腺癌A549细胞Bcl 2基因的表达,增强A549细胞对X线的放射敏感性。     

外源野生型p53基因对人胆囊癌GBC-SD细胞生长的作用

目的观察外源野生型p53(wtp53)基因对人胆囊癌GBC-SD细胞生长的抑制作用。方法用脂质体介导的转染技术,将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53导入GBC—SD细胞。用聚合酶链反应(PCR)和逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)证实外源p53基因的整合与表达;用细胞计数和克隆形成实验反映细胞增殖状况;用流式细胞仪检测细胞周期的改变。结果转化细胞系中存在外源p53基因的整合与表达。稳定转染wtp53基因的GBC-SD-wtp53细胞,体外生长速率明显减慢;克隆形成率仅为3．2％,显著低于对照组GBC-SD-mutp53(28％)和亲本GBC-SD细胞 (29％,P<0．01);G0／G1期、S期、G2／M期比例(％)分别为(66．12±4．2、32．87±2．15、1．01± 0．37),与对照组(46．20±5．1、30．78±2．92、23．02±1．87)及亲本细胞(41．25±3．2、40．03±2．09、 18．72±1．05)相比,G0／G1期细胞比例明显增加,G2／M期细胞比例显著减少(P<0．01)。结论外源野生型p53基因的表达能有效抑制人胆囊癌GBC-SD细胞的体外生长。     

利用裸鼠建立人肝门部胆管癌肝门移植模型

目的:应用肝门部胆管癌细胞系FRH及组织块法建立裸鼠人肝门部胆管癌肝门移植模型,观察肿瘤局部浸润和远处转移情况.方法:20只裸鼠取上腹部切口,显露肝门部,取裸鼠皮下移植瘤边缘直径约1mm组织块植入肝门部肝实质内.观察裸鼠生命体征的变化,定期处死裸鼠,取血查肝功,取肝门肿瘤、肝脏、胰腺、脾脏、胃肠、肺脏标本福尔马林液固定,苏木素-伊红染色后显微镜下观察,肝门移植瘤电镜观察.结果:20只模型全部建立成功,成瘤率100%,2周左右可触及肝门部有小结节,平均4周出现黄疸,6周左右裸鼠出现明显恶液质.解剖后发现肝门部肿瘤侵及胆囊、肝门血管和腹腔淋巴结.胰腺、脾脏、胃肠、肺脏未见转移灶.结论:肝门部胆管癌肝门移植模型成瘤率高,其转归接近临床,可用于肝门部胆管癌的实验研究.     

宫颈癌及子宫内膜癌细胞系中hTERT启动子活性的研究

目的：探讨Hela及HHUC细胞系中hTERT启动子的活性及其与hTERT mRNA表达和端粒酶活性之间的关系。方法：将hTERT核心启动子基因转入Hela、HHUC细胞系、人正常皮肤表皮细胞及子宫内膜上皮细胞中，检测细胞系hTERT启动子的活性、hTERT mRNA表达水平及端粒酶活性。分别以HEK293细胞系作为阳性对照，HELF细胞系作为阴性对照。结果：细胞系Hela、HHUC、人正常皮肤表皮细胞及正常子宫内膜上皮细胞中的hTERT启动子活性分别为20．1％、14．9％、0．3％和0．5％；hTERT mRNA相对表达水平分别为0．63、0．51、0和0；端粒酶活性分别为0．393、0．387、0．144和0．152。结论：宫颈癌细胞系及子宫内膜癌细胞系中hTERT启动子活性、hTERT mRNA表达水平和端粒酶活性均特异性增高，而在正常角化细胞及子宫内膜上皮细胞中则被抑制或不表达。hTERT启动子活性水平与hTERT mRNA表达水平和端粒酶活性之间有显著相关性。     

氟化物对限制性内切酶酶切活性改变的研究

目的：探讨氟化物对限制性内切酶酶切作用改变的影响。方法：常规方法提取纯化PBR322质粒；将NaF与PBR322质粒37℃共同作用1h，再用限制性内切酶BamH1对PBR322质粒进行酶切3h，同时将NaF作用的PBR322用层析柱纯化后再进行酶切反应；将酶切产物进行电泳，观察结果并拍照。结果：随着NaF浓度的增加，BamH，对PBR322的酶切作用减弱，当加入5mmol／LNaF时，BamH1几乎无酶切活性，而对加入5mmol／LNaF的PBR322用层析柱进行纯化，以除去NaF，再对其进行酶切，可完全切开。而且氟离子可导致酶切片段在电泳中显示拖尾现象。结论：氟化物可抑制限制性内切酶的酶切活性。     

γ-干扰素对姜黄素抑制人卵巢癌细胞株3AO增殖的影响

目的 :研究γ 干扰素 (IFN γ)对姜黄素抑制人卵巢癌细胞株 3AO增殖的影响。方法 :采用MTT法计算细胞存活率、Giemsa染色观察细胞形态变化及凋亡情况、流式细胞术检测细胞周期变化。结果 :姜黄素可明显抑制 3AO细胞的生长 ,其半数生长抑制率 (IC50 )约为 1 8.5 μmol/L;姜黄素将肿瘤细胞聚集在S期和G2 /M期并可诱导细胞凋亡。IFN γ与姜黄素联用后 ,使上述作用明显增强 ,与两药单用组相比有统计学差异(P <0 .0 5 )。结论 :IFN γ可协同姜黄素抑制人卵巢癌细胞株 3AO增殖     

人胆囊癌裸鼠皮下瘤模型特性的初步观察

目的:建立人胆囊癌裸鼠皮下瘤模型,并对其生物学特性进行初步观察。方法:培养人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞,收集细胞并制备细胞悬液。每只裸鼠于股外侧皮下注射GBC-SD细胞悬液0.2ml(约2×106个细胞),共30只。观察GBC-SD细胞系成瘤率、成瘤时间、肿瘤生长情况及对裸鼠机体状况的影响。解剖观察瘤体情况并行病理切片观察。结果:裸鼠成瘤率为100%,GBC-SD细胞系对高周龄裸鼠亦有致瘤性,成瘤时间为1周左右。裸鼠于注射瘤细胞后约8周出现恶液质,晚期恶液质明显并衰竭死亡。荷瘤生存期平均为20周。结论:GBC-SD人胆囊癌裸鼠皮下瘤模型成瘤率高,GBC-SD细胞系对高周龄裸鼠亦有致瘤性。肿瘤生长速度稳定,易于观察,可作为胆囊癌治疗等研究的良好平台。     

免疫性血小板减少症患者外周血中microRNA-181a、microRNA-146a、microRNA-326及microRNA-142-3p的表达

目的 通过检测4种免疫相关的microRNAs （miR-181a、miR-146a、miR-326和miR-142-3p）在免疫性血小板减少症（ITP）患者外周血单个核细胞（PBMCs）中的表达,探讨miRNA在ITP中的作用及意义。方法 采用实时定量PCR（RT-PCR）法,检测34例ITP患者（ITP组）及31例健康人（正常对照组）外周血PBMCs中4种miRNAs的表达水平;改良MAIPA法检测ITP组中22例患者抗血小板自身抗体GPIIb/IIIa、GPIb/IX,分析miRNA与抗血小板自身抗体的关系,以及与血小板计数等临床指标的相关性。结果 ITP组PBMCs中miR-146a、miR-326和miR-142-3p表达水平与正常对照组相比明显降低（P<0.05）,miR-146a与miR-326 (r=0.437, P=0.011）,miR-146a与miR-181a (r=0.652, P<0.001),miR-326与miR-181a(r=0.745, P<0.001）的表达水平均呈显著正相关,且miR-146a与ITP患者血小板计数呈正相关（r=0.468,P=0.016）。ITP组不同性别间4种miRNAs表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。ITP组中26例患者接受糖皮质激素治疗后,有效组与无效组4种miRNAs表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。GPIb/IX、GPIIb/IIIa单阳性组、双阳性组和双阴性组间miRNAs的表达水平均无显著性差异（P>0.05）。结论 miR-146a、miR-326及miR-142-3p表达异常在ITP的发生和发展中可能发挥了一定的作用。     

Rb94联合放疗对裸鼠肺腺癌皮下移植瘤的抑制作用

目的  观察人视网膜母细胞瘤基因（Rb94）对裸鼠肺腺癌皮下移植瘤的放射增敏作用及其机制。方法  将40只裸鼠分别皮下接种5×106个A549细胞,当肿瘤长至180mm3时随机分为8组,每组5只,即空白对照组、空白对照+射线组、脂质体组、脂质体+射线组、空载体组、空载体+射线组,每两组分别于肿瘤内注射PBS、脂质体、pIRES。另有转染Rb94基因组、转染Rb94基因+射线组,分别注射pIRES-Rb94。空白对照+射线组、脂质体+射线组、空载体+射线组、转染Rb94基因+射线组裸鼠瘤体内注射后加照一定剂量X线。观察肿瘤生长情况并计算抑瘤率,采用实时RT-PCR和Western bolt法检测瘤组织中Rb94基因的表达,Hoechst染色观察细胞凋亡情况,实时RT-PCR检测hTERT、Bcl-2mRNA的表达,免疫组织化学SP法检测细胞周期阻滞。结果  转染Rb94基因+射线组抑瘤率为95.84%,与转染Rb94基因组和空白对照+射线组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论  Rb94基因对裸鼠皮下移植瘤具有明显的抑制作用,联合射线抑瘤效果更好,其作用机制可能与Rb94基因引起细胞凋亡、G2/M期周期阻滞以及下调hTERT、Bcl 2 mRNA的表达有关。     

抑制磷脂酰肌醇-3-羟基激酶/蛋白激酶B信号传导通路对宫颈癌放疗增敏的作用

目的:探讨抑制磷脂酰肌醇-3-羟基激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号传导通路对宫颈癌的放疗增敏作用。方法:选用LY294002为PI3K阻滞剂。培养PI3K功能活性和AKT磷酸化水平稳定的人宫颈癌HeLa细胞株,皮下注射于BALB/C裸鼠体内,建立裸鼠宫颈癌移植瘤模型。随机将荷瘤裸鼠分为空白对照组、单纯放疗组、单纯药物组(LY294002)和联合治疗组(放疗+LY294002)。应用Western blotting检测各组AKT磷酸化(phospho-Ser473AKT)水平。通过克隆形成实验检测LY294002在体内的放射增敏作用。长期观察肿瘤体积的变化并绘制肿瘤生长曲线。结果:Western blotting显示,联合治疗组的AKT去磷酸化现象最显著。克隆形成实验显示,LY294002与放射治疗对肿瘤细胞生长的抑制在各剂量水平均表现出协同作用(P0.05)。肿瘤生长曲线表明联合治疗组的肿瘤体积增长最缓慢。结论:PI3K阻滞剂显著增强宫颈癌对放射治疗的敏感性。