Rb94对人肺腺癌细胞系A549放射增敏作用的实验研究

目的 构建人视网膜母细胞瘤基因(Rb94)真核表达载体,观察其对人肺腺癌细胞系A549的放射增敏作用并探讨其机制.方法 构建重组表达质粒pIPES-Rb94,经脂质体转染A549细胞、G418筛选获得稳定转染的细胞系.细胞计数法绘制生长曲线、计算细胞倍增时间;实时RT-PCR检测hTERT、Bcl-2mRNA的表达;成克隆实验检测pIRES-Rb94对A549细胞放射敏感性影响,计算放射增敏比(SER);流式细胞仪分析细胞周期.结果 成功构建pIRES-Rb94质粒,转染A549细胞后获得稳定转染细胞系pIRES-Rb94-A549.与A549细胞相比,pIRES-Rb94-A549细胞倍增时间延长(31.5h:39.5 h;t=5.15,P<0.01);hTERT、Bcl-2 mRNA表达下降(0.02:1.00;t=18.99,P<0.01;0.01:1.00;t=13.73,P<0.01);G2+M期细胞增加(35.91%:4.53%;t=36.78,P=0.00),G0+G1期和S期细胞减少(47.02%:74.07%;t=11.71,P=0.00和17.07%:22.32%;t=2.30,P<0.05);由D0值计算的SER为1.30.结论 Rb94对A549细胞具有明显放射增敏作用,其机制可能是G2+M期阻滞作用以及下调hTERT、Bcl-2 mRNA表达,并可能通过调节细胞周期来影响细胞增殖.     

自身免疫性血小、板减少性紫癜的特异性免疫学诊断的研究

目的 检测自身免疫性血小板减少性紫癜（AITP）患者及非免疫性血小板减少症患者的抗血小板特异性抗体,并与血小板相关抗体（PAIgG)相比较,评价其诊断及鉴别诊断价值。方法 用酶联免疫吸附竞争法检测PAIgG,改良单克隆抗体特异性俘获血小板抗原（MAIPA）技术检测抗血小板GPⅡb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ的特异性抗体。结果 血小板特异性抗体较PAIgG的敏感性低,但特异性明显增强。结论 抗血小板特异性抗体对鉴别免疫性与非免疫性血小板减少具有重要临床意义。     

重组表达载体plRES Rb94的构建及其对肺腺癌A549细胞株中SphK表达的影响

目的构建真核表达质粒pIRES Rb94,观察Rb94基因对鞘氨醇激酶（SphK）表达的影响。方法根据Rb94基因序列设计、合成引物,构建以内部核糖体进入位点（IRES）相连的Rb94基因的真核表达质粒pIRES Rb94,经脂质体转染A549细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。采用Real time RT PCR和Western boltting法检测Rb94基因并观察其对人肺腺癌A549细胞株SphK表达的影响。结果成功构建重组表达质粒pIRES Rb94,转染A549细胞后获得稳定转染细胞株pIRES Rb94 A549,该细胞株中Rb94基因高效表达;SphK1表达下调而SphK2表达上调。结论真核表达质粒pIRES Rb94构建成功并可有效转染A549细胞,Rb94基因抑制SphK1的表达,增强SphK2的表达。     

复制缺陷性慢病毒介导的双自杀基因在小鼠异基因骨髓移植中的应用

目的　探讨复制缺陷性慢病毒介导的胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase,CD)和胸苷激酶(thymidinekinase ,TK)双自杀基因在异基因骨髓移植 (allo BMT)时控制移植物抗宿主病 (GVHD)的可行性及其有效性。方法　将携带双自杀基因的复制缺陷性慢病毒通过脂质体转染入T细胞中。将经6 0　Coγ射线照射后的荷瘤小鼠分组进行骨髓移植 ,观察骨髓移植后荷瘤鼠CFU S、CFU GM、Y染色体整合、T细胞中CD TK基因整合、生存率和生存期、体重及病理组织学等指标。结果　复制缺陷性慢病毒载体可将双自杀基因高效稳定转染入T细胞。在allo BMT中 ,除空白对照组外 ,各组小鼠的CFU S的数目和CFU GM产率差异无显著性 ,且均有Y染色体整合。使用前体药物治疗的小鼠未发生明显的GVHD ,其生存率和生存期明显高于其它各组 ;双自杀基因的效果优于单自杀基因。结论　复制缺陷性慢病毒介导的双自杀基因系统可在不影响移植物存活的情况下有效控制GVHD的发生 ,显著提高allo BMT的成功率。     

双自杀基因慢病毒转移载体系统的构建及其对K562细胞的杀伤作用

为了探讨双自杀基因慢病毒转移载体系统对K562细胞的杀伤作用,采用分子生物学方法构建了含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(E.coli CD)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)的双自杀基因慢病毒转移载体,将慢病毒基因转移系统中的3种成分质粒(目的基因转移载体、包装结构及包膜结构质粒)用脂质体分为2组(实验组、对照组)共转染入病毒包装细胞293T,在荧光显微镜下观察转染效果,在透射电镜下观察上清中的病毒颗粒.大量收集病毒上清,浓缩后感染K562细胞,荧光显微镜下观察感染效果,RT-PCR鉴定目的基因在K562细胞中的整合转录.给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和(或)无环鸟苷(GCV)后,用MTT法测定体外杀伤效应,扫描电镜下观察使用前体药物后K562细胞的变化.结果表明成功构建了双自杀基因慢病毒转移载体,脂质体法可有效将上述慢病毒表达质粒转入293T细胞.荧光显微镜下观察到对照组大量绿色荧光蛋白(green fluorescenceprotein,GFP)表达.透射电镜下观察到大量浓缩后病毒颗粒.荧光显微镜下观察到此基因转移载体系统对293T细胞及K562细胞的感染率均很高,单独使用GCV或5-FC对转染自杀基因的K562细胞的生长抑制率(growth inhibition ration,GIR)分别为48.73%、50.16%,与未转染K562细胞比较明显升高,有显著性差异(P＜0.01),联合使用5-FC和GCV时K562细胞的GIR为87.69%,比单独使用5-FC或GCV时明显升高,有显著性差异(P＜0.01).结论双自杀基因慢病毒基因转移载体系统可将双自杀基因高效转移至K562细胞,是一种有效的基因转移载体系统.     

脂质体介导c-myc反义寡核苷酸诱导HeLa细胞凋亡的实验研究

目的体外研究C-MYC反义寡核苷酸(ASODN)对人宫颈癌HELA细胞凋亡的影响,寻求提高肿瘤细胞放射敏感性的方法。方法免疫组化、流式细胞术、半定量RT-PCR法鉴定ASODN的有效性;GIEMSA染色、流式细胞术检测凋亡指数(AI)、DNA LADDER检测细胞凋亡。结果转染后,免疫组化结果显示C-MYC蛋白表达降低;半定量RT-PCR结果显示C-MYC MRNA表达较空白对照组及阴性对照组明显减弱(P<0.05)。GIEMSA染色可见凋亡小体;流式细胞术结果显示转染后凋亡指数为(10.29±0.66)%,转染ASODN(C-MYC)联合放射的凋亡指数为(16.83±0.57)%,均明显高于空白对照组(1.79±0.19)%(P<0.05);DNA LADDER呈现具有凋亡特征的梯带。结论本实验所设计的ASODN能有效地抑制C-MYC基因的表达;转染ASODN(C-MYC)能够显著增加HELA细胞凋亡,从而提高肿瘤细胞的放射敏感性。     

PAICA法检测ITP病人血小板特异抗体的临床应用

（1）目的：检测特发性血小板减少性紫癜（ITP）病人及非免疫性血小板减少症病人的抗血小板特异性抗体，并探讨其临床意义；（2）方法：采用血小板相关抗体特性检测技术（PAICA法），检测52例ITP病人，31例非免疫性血小板减少症病人抗血小板GPⅡb/Ⅲa,GPⅠb/Ⅸ的特异性抗体，并与血小板相关抗体IgG(PAIgG)检测结果进行了比较。（3）结果：血小板特异抗体检测的可能性比值及阳性预测值较高，但阴性预测值较低，而PAIgG检测的可能性比值，阳性预测值及阴性预测值均较低。（4）结论：血小板特异抗体检测对肯定ITP诊断有重要的意义，对排除ITP诊断意义不大。     

Notch分子与其配体在32D细胞分化过程中的作用

目的 探讨Notch信号传导系统的作用机制及其对造血系统的影响。方法 将报告基因TP1瞬时转染Notch－CHO和Notch2－CHO细胞后，分别加入转染有不同Notch配体Deltal,Delta4,Jagged1,Jagged2的CHO细胞及正常未转染的CHO细胞，使Notch分子与其配体充分结合并发挥作用，加入发光底物PGL－100，用Lumat测定发光情况。将Notch1－32D细胞加入含G－CSF培养液的CHO，Jagged2-CHO及Delta4-CHO细胞中，观察Notch1－32D细胞分化及分化抑制情况。结果 5种Notch配体与Notch1结合后均能引起荧光素酶活性增高，Jagged2-CHO,Delta4-CHO1-4,Delta4-CHO1-5尤为明显。对Notch2来讲，5种配体均可引起TP1活性的增高。在G－CSF存在下，Notch1－32D细胞可分化为成熟的粒细胞；通过分化抑制实验发现Jagged2能抑制G－CSF引起的Notch1－32D细胞分化，但Delta4不能抑制GCSF引起的Notch1－32D细胞分化。Jadded2,Delta4为Notch1分子的配体，Delta4不能抑制G－CSF引起的Notch1－32D细胞分化，但Jagged2能抑制G－CSF引起的Notch1－32D细胞分化。     

双自杀基因体系对胆囊癌细胞体内外杀伤作用的研究

目的　研究联合应用双自杀基因对胆囊癌细胞的杀伤作用。方法　将GBC SD/CD tk细胞和GBC SD细胞分别接种于裸鼠皮下 ,观察前体药物应用前后肿瘤体积的变化。将CD和HSV tk自杀基因转染胆囊癌细胞GBC SD ,MTT法观察 5 氟胞嘧啶或 /和丙氧鸟苷的杀伤作用。结果　单独应用 5 氟胞嘧啶或丙氧鸟苷均能对转染阳性的胆囊癌细胞GBC SD/CD tk产生明显的杀伤效应 ,联合应用可以产生更大的杀伤作用 ,旁观者效应明显 ;GBC SD/CD tk和GBC SD细胞分别接种裸鼠后成瘤性无明显差别 ,转染组的杀伤作用明显 ,体内局部旁观者效应明显。结论　双自杀基因的应用对胆囊癌细胞具有明显的杀伤作用 ,其旁观者效应明显。