重组乙肝疫苗的研究进展

乙型病毒性肝炎（简称乙肝）是由乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）感染所致。HBV为嗜肝病毒,通过受感染者的血液或其他体液传播,引起肝细胞炎症、坏死、纤维化。乙肝分急性和慢性2种。急性乙肝在成人中90％可自愈,慢性乙肝可发展成肝硬化,甚至肝癌。乙肝在世界各国均有流行,我国属于高流行区。据统计,全球现有20多亿人感染过HBV,其中（3．5～4）亿人为慢性HBV携带者,我国有1．2亿人,     

新生牛皮胶原蛋白海绵的制备及其体外细胞相容性

目的:采用新生牛皮提取胶原蛋白、制备生物医用胶原蛋白海绵,观察其生物学活性与细胞相容性。方法:实验于2006-05/2007-02在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。实验方法:①取出生24h内宰杀的新生尕里巴牛犊皮制备胶原蛋白海绵。②将新生牛皮胶原蛋白海绵与黑裘皮羔羊肾F3代成纤维细胞混悬液共培养,分别设胶原海绵材料组、阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(橡胶塞浸提液)。实验评估:①应用倒置相差显微镜观察细胞形态。②培养20,35d对细胞与胶原蛋白海绵共培养物进行AO染色观察细胞在胶原海绵中的增殖情况。③培养65d后制石蜡切片,行苏木精-伊红染色观察细胞在胶原海绵中的生长情况。结果:①细胞形态观察结果:阳性对照组细胞培养24h细胞圆缩,不贴壁,3d后全部死亡。胶原海绵材料组与阴性对照组细胞形态均正常,细胞贴壁生长良好。随着培养时间的延长,海绵孔隙逐渐变小,细胞数量增加,形态变小,海绵外观从柔软、混浊变得挺拔、透明。②细胞在胶原海绵中的增殖情况:吖啶橙-AO染色显示培养20,35d胶原海绵-羔羊肾成纤维细胞共培养物中有大量细胞存在,并且在胶原蛋白空隙中有大量细胞成团簇状生长。③细胞在胶原海绵中的生长情况:苏木精-伊红染色显示有大量蓝色细胞核和新生的红色胶原纤维。结论:制备的新生牛皮胶原蛋白海绵对岷县黑裘皮羔羊肾成纤维细胞有良好的生物相容性,无细胞毒性。     

新生牛跟腱胶原蛋白海绵与动物肾、睾丸、皮肤细胞的生物相容性

背景：随着新生牛血清的产业化，新生牛跟腱资源大量积累，使得利用其制备医用胶原蛋白海绵并产业化成为可能。 目的：采用新生牛跟腱制备胶原蛋白海绵，观察其与Vero 细胞、天祝白牦牛胚胎皮肤细胞和岷县黑紫羔羊睾丸细胞的生物相容性。 设计、时间、地点：重复测量观察，于2006- 02/05 在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。 材料：用出生24 h内的新生牛跟腱经冰醋酸、胃蛋白酶等消化, 经盐析、透析及冻干等处理后，制成胶原蛋白海绵。天祝白牦牛胚胎皮肤f2代细胞和岷县黑紫羔羊睾丸f2代细胞为自制，Vero 细胞为协和医科大学细胞中心提供。 方法：在6孔板中, 将3种细胞分别接种于经紫外线、臭氧灭菌后的胶原蛋白海绵上，于37 ℃、 体积分数为0.05 的CO2 恒温箱培养，同时设对照实验。 主要观察指标：相差显微镜观察接种5，12，24，72 h时 3种细胞在胶原蛋白海绵上和6孔板底的生长情况，接种11 d对共培养物行考马斯亮蓝、苏木精-伊红染色。 结果：接种后5 h, 在胶原蛋白海绵周围的6孔板底部可看到细胞已贴壁、伸展, 个别细胞有分裂现象, 在胶原蛋白海绵表面, 隐约可见圆形细胞排列。接种后48~72 h 时, 6孔板底部细胞铺满单层。接种后11 d，考马斯亮蓝和苏木精-伊红染色显示3 种共培养物中均有大量细胞良好生长, 胶原海绵外观变得挺拔、透明、有韧性。 结论：新生牛跟腱胶原蛋白海绵与上述3种来自不同动物、不同组织的细胞有很好的生物相容性，可做皮肤细胞、肾细胞和睾丸细胞的培养支架。     

人脑心肌炎病毒免疫球蛋白M捕获酶联免疫吸附试验的建立及初步应用

目的建立脑心肌炎病毒(EMCV)免疫球蛋白M(IgM)捕获酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,用于感染EMCV血清学早期诊断。方法用抗人IgM(μ链)单抗进行包被,辣根过氧化物酶(HRP)标记的EMCV为酶标抗原,初步建立EMCV IgM捕获ELISA;对建立的方法进行条件优化及特异性、精密性、稳定性等验证。结果建立的EMCV IgM捕获ELISA检测方法抗体包被浓度为1μg/mL,EMCV-HRP工作浓度和反应时间分别为1∶400和45min,封闭液为10%马血清时该法检测效果可达最佳,3批试剂批内及批间变异系数均小于5%,且特异性、精密性及稳定性较好。结论建立的EMCV IgM捕获ELISA法特异、精密且稳定,可用于人感染EMCV的早期检查,为EMCV的诊断奠定基础。     

脑心肌炎病毒 TaqMan real-time PCR检测方法的建立及应用

目的建立脑心肌炎病毒（ EMCV） TaqMan real-time PCR检测方法。方法根据GenBank中公布的EMCV 3D基因保守区段设计并合成1对引物和1条TaqMan 探针,建立EMCV TaqMan real-time PCR检测方法,且对体系进行优化;对该法进行灵敏性、特异性验证;采用建立的方法对98份猪血清样本进行检测,并与ELISA结果进行比较。结果建立的EMCV TaqMan real-time PCR检测方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数R2为0．995;灵敏性比普通PCR高100倍,且仅能特异性检出 EMCV;对猪血清样本的检测与 ELISA 法检测结果符合率为98．0％。结论已建立了EMCV TaqMan real-time PCR检测方法,该法灵敏性高、特异性好,可用于EMCV的检测及定量分析。     

MDCK悬浮细胞制备及流感病毒敏感性研究

目的 建立无血清悬浮培养MDCK细胞的方法,分析其传代、线性放大过程中的稳定性及增殖流感病毒的敏感性。方法 运用逐步降血清悬浮驯化法将贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞;进一步分析其生长动力学特性、连续传代稳定性,在5L生物反应器中扩大培养;接种流感和禽流感病毒,测定不同时间HA效价、CCID₅₀滴度,分析其病毒敏感性。结果 成功将ATCC引进的贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞(命名为MDCK-XF02细胞)并冻存;不同接种密度培养MDCK-XF02细胞最大增殖密度均达13.0×10⁶ cells/mL以上,且差异无统计学意义(P>0.05);连续传代培养过程中细胞形态和生长状况稳定,比生长速率差异无统计学意义(P>0.05);三个代次的MDCK-XF02细胞以2.0×10⁶ cells/mL接种于5 L生物反应器,细胞生长状态良好,倍增时间小于21 h,在批培养中细胞浓度高达(14.57±0.47)×10⁶ cells/mL,比生长速率分别为(0.027±0.012)h^-1、(0.028±0.013)h^-1、(0.027±0.013)h^-1(P>0.05);接种甲型流感病毒H1N1和H3N2,HA效价达到(6~7)log₂HA/25 μL、CCID₅₀为(4.35~4.68)lgCCID₅₀/mL;接种乙型流感病毒B/P和BX-35增殖效果更好,HA效价达到(9~10)log₂HA/25 μL,CCID₅₀为(6.38~7.31)lgCCID₅₀/mL。接种重组禽流感病毒H5亚型Re-5、Re-6、Re-10均能很好的增殖,HA效价达到(7~9)log₂HA/25 μL、CCID₅₀为(6.21~6.96)lgCCID₅₀/mL。结论 本研究获得一株具有自主知识产权的流感/禽流感病毒敏感的无血清悬浮培养型MDCK-XF02细胞株,实现了生物反应器高密度放大培养,为我国开展流感疫苗研究和生产提供细胞基质,也为其他动物细胞悬浮驯化提供参考。     

新生牛皮胶原蛋白海绵的制备及其体外细胞相容性☆◆

背景：现已证实，人肌腱、牛肌腱、鼠尾、猪皮、新生牛跟腱制备的胶原蛋白海绵有良好的细胞相容性。 目的：采用新生牛皮提取胶原蛋白、制备生物医用胶原蛋白海绵，观察其与羔羊肾成纤维细胞的相容性。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2006-05/2007-02在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。 材料：出生24 h内宰杀的新生尕里巴牛犊皮，岷县黑裘皮羔羊肾原代成纤维细胞。 方法：取新生牛犊皮，经脱毛、胃蛋白酶+冰醋酸联合处理、盐析、透析、冻干后制备胶原蛋白海绵。将海绵与羔羊肾F3代成纤维细胞混悬液共培养，分别设胶原海绵材料组、阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（橡胶塞浸提液）。 主要观察指标：应用倒置相差显微镜及JVC数码摄像系统观察、拍摄与记录细胞形态、生长情况。培养20，35 d，对共培养物进行AO染色，观察细胞在胶原海绵中的增殖情况。培养65 d后制石蜡切片，行苏木精-伊红染色，观察细胞在胶原海绵中的生长情况。 结果：阳性对照组细胞培养24 h细胞圆缩，不贴壁，3 d后全部死亡。胶原海绵材料组与阴性对照组细胞形态均正常，细胞贴壁生长良好。随着培养时间的延长，海绵孔隙逐渐变小，细胞数量增加，形态变小，海绵外观从柔软、混浊变得挺拔、透明。AO染色显示培养20，35 d的胶原海绵-羔羊肾成纤维细胞共培养物中有大量细胞存在，并且在胶原蛋白空隙中有大量细胞成团簇状生长。苏木精-伊红染色显示有大量蓝色细胞核和新生的红色胶原纤维。 结论：制备的新生牛皮胶原蛋白海绵对岷县黑裘皮羔羊肾成纤维细胞有良好的相容性。     

新生牛跟腱胶原蛋白海绵与动物肾、睾丸、皮肤细胞的生物相容性

背景：随着新生牛血清的产业化，新生牛跟腱资源大量积累，使得利用其制备医用胶原蛋白海绵并产业化成为可能。目的：采用新生牛跟腱制备胶原蛋白海绵，观察其与Vero细胞、天祝白牦牛胚胎皮肤细胞和岷县黑紫羔羊睾丸细胞的生物相容性。设计、时间、地点：重复测量观察，于2006-02／05在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。材料：用出生24h内的新生牛跟腱经冰醋酸、胃蛋白酶等消化，经盐析、透析及冻干等处理后，制成胶原蛋白海绵。天祝白牦牛胚胎皮肤f2代细胞和岷县黑紫羔羊睾丸f2代细胞为自制，Vero细胞为协和医科大学细胞中心提供。方法：在6孔板中，将3种细胞分别接种于经紫外线、臭氧灭菌后的胶原蛋白海绵上，于37℃、体积分数为0．05的CO2恒温箱培养，同时设对照实验。主要观察指标：相差显微镜观察接种5，12，24，72h时3种细胞在胶原蛋白海绵上和6孔板底的生长情况，接种11d对共培养物行考马斯亮蓝、苏木精-伊红染色。结果：接种后5h，在胶原蛋白海绵周围的6孔板底部可看到细胞已贴壁、伸展，个别细胞有分裂现象，在胶原蛋白海绵表面，隐约可见圆形细胞排列。接种后48～72h时，6孔板底部细胞铺满单层。接种后11d，考马斯亮蓝和苏木精-伊红染色显示3种共培养物中均有大量细胞良好生长，胶原海绵外观变得挺拔、透明、有韧性。结论：新生牛跟腱胶原蛋白海绵与上述3种来自不同动物、不同组织的细胞有很好的生物相容性，可做皮肤细胞、肾细胞和睾丸细胞的培养支架。