不同直径神经干细胞球慢速低温冻存的研究

为提高神经干细胞冻存复苏后的效果及存活率,对不同尺寸与状态的神经干细胞球进行了在不同浓度DMSO(二甲基亚砜)下的慢速冻存比较.首先用CCK-8试剂盒测定神经干细胞的生长曲线,然后对处于对数生长期的3类神经干细胞(单细胞悬液,直径30～50 μm球,直径80～100 μm球)分别进行了7个不同浓度(3%,5%,7%,8%,10%,15%,20%)DMSO的冻存实验比较,并对冻后复苏的细胞进行活性检测和诱导分化.结果表明, 直径80～100 μm的神经干细胞球,DMSO浓度8%,复苏后细胞活率82.9%,且仍具有多项分化潜能.神经干细胞间的亲密联系和刻痕信号与直径尺寸共同作用,影响着神经干细胞的冻存复苏效果.     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体在骨髓间充质干细胞中的表达

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，是一种理想的治疗性细胞和基因治疗的靶细胞。 目的：观察脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达。 设计、时间及地点：单一样本观察的细胞基因工程实验，于2006-03/2007-04在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。 材料：5月龄新西兰大白耳兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养。 方法：采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。酶切鉴定后，采用Lipofectamine 2000介导胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。 结果：成功克隆了胞嘧啶脱氨酶基因，基因测序结果同Genbank中公布的序列一致。将胞嘧啶脱氨酶基因亚克隆到pIRES2-AcGFP1质粒上，构建了pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体。利用脂质体介导法将胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞，24h后在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。 结论：pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体已成功转入骨髓间充质干细胞中，说明骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体在骨髓间充质干细胞中的表达

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，是一种理想的治疗性细胞和基因治疗的靶细胞。目的：观察脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达。设计、时间及地点：单一样本观察的细胞基因工程实验，于2006—03／2007—04在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。材料：5月龄新西兰大自耳兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养。方法：采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。酶切鉴定后，采用Lipofectamine 2000介导胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞。主要观察指标：倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。结果：成功克隆了胞嘧啶脱氨酶基因，基因测序结果同Genbank中公布的序列一致。将胞嘧啶脱氨酶基因亚克隆到pIRES2-AcGFP1质粒上，构建了pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体。利用脂质体介导法将胞嘧啶脱氨酶基因转染骨髓间充质干细胞，24h后在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体已成功转入骨髓间充质干细胞中，说明骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。     

体外神经干细胞三维药物筛选模型的构建

研究目的：建立中药对神经干细胞诱导转变为神经细胞的体外模型，不仅对研究脑的发育和分化以及神经系统疾病的治疗具有重要价值，而且也有助于了解中药的作用机制，为中药的临床应用提供坚实的科学依据。本研究评价体外海马神经干细胞在胶原凝胶内的生长情况，探讨胶原凝胶作为神经系统组织支架材料的可行性，以建立适合于干细胞药物筛选及作用机理研究的三维培养模型。研究方法：①细胞培养：体外培养来源于孕13天胎鼠的海马部位神经干细胞，传至第三代；根据胶原的特性，把神经干细胞均匀混合于胶原的预凝胶溶液中，便可形成“细胞．胶原”的凝胶三维结构。②检测指标：倒置相差显微镜和激光共聚焦显微镜观察胶原凝胶中神经干细胞的生长、伸展情况；通用免疫细胞化学方法及荧光显微技术鉴定神经干细胞，BrdU染色标记增殖的细胞；采用CCK-8法及Live／DeadViability／CytotoxicityKit试剂盒检测神经干细胞不同培养条件下的生存和增殖能力，筛选出最佳的胶原工作浓度。结果：①倒置相差显微镜下观察发现胶原凝胶中的神经干细胞生长状态良好；     

海藻酸钙微胶珠培养神经干细胞研究

神经干细胞作为一种具备自我更新及多向分化潜能的细胞,已经引起国内外研究者的高度关注。神经干细胞的发现、研究与应用,将在治疗神经系统疾病以及神经损伤的修复中起到重要作用,但是神经干细胞的来源受限及数量不足是临床应用的最大障碍。采用三维动态培养从而实现神经干细胞大规模扩增是解决其数量不足的有效方法。但是,在三维动态搅拌条件下,剪切力对细胞的损害是非常大的。考虑到海藻酸钙微胶珠在细胞培养领域的应用,如果把神经干细胞包囊到微胶珠中进行动态培养,将会避免剪切力对干细胞的损伤,因此是一个非常值得期待的干细胞培养方式。本研究在静态条件下,采用海藻酸钙微胶珠作为神经干细胞的3D培养手段,对成囊工艺进行了探索,以确定适于培养神经干细胞的最佳胶珠制备工艺。通过微胶珠内部的扩散传质模型,研究了微胶珠制备工艺中各参数对其扩散系数(D)的影响,找出微胶珠最佳制备工艺参数为:直径2mm,1.5%(wt%)海藻酸钠滴入3.5%(wt%)CaCl2中,反应时间10min。确定上述工艺后,对小鼠神经干细胞进行了不同包囊密度条件下的培养,得到包囊神经干细胞的最佳密度为0.08×106cells.mL-1。此外,本研究还对海藻酸钙微胶珠培养的神经干细胞进行了nestin等特异性蛋白的免疫荧光化学染色,结果为阳性,表明所培养的神经干细胞能够保持其干细胞的特性。本研究结果表明,采用优化参数制备的海藻酸钙微胶珠是培养神经干细胞的有效手段。同时也为动态微囊培养神经干细胞打下了良好基础。     

Lipofectamine介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞*☆

背景：自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷。胞嘧啶脱氨酶即可产生强大的旁观者效应。 目的：观察脂质体介导真核表达载体胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达。 设计、时间及地点：细胞学基因水平体外实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。 材料：SPF级C57BL纯系小鼠6只,体质量18~20 g,用于骨髓间充质干细胞的分离培养。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供。LipofectamineTM 2000脂质体为Invitrogen产品。 方法：取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,提取质粒DNA,对质粒plRES2-cGFP1-CD进行XhoI和BamHI双酶切,用于转染。取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用LipofectamineTM 2000介导法转染第3代鼠骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测鼠骨髓间充质干细胞表面标记表达,荧光倒置显微镜观察细胞转染36,48 h后胞嘧啶脱氨酶基因的表达。 结果：质粒plRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0~1.5 kb处有1条带出现,符合胞嘧啶脱氨酶基因长度。流式细胞仪检测显示细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性。plRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强。 结论：脂质体介导的胞嘧啶脱氨酶基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值。     

神经干细胞球在生物反应器内培养的模拟计算

采用元胞自动机技术建立的模拟神经球生长的动态模型，结合反应器中培养的神经球内部养分的扩散传递模型，求解了神经干细胞球内出现坏死细胞核的临界神经球尺寸和坏死细胞核的扩大规律，以及反应器内养分浓度的变化情况。计算结果表明，坏死细胞核的出现与体外培养条件有一定关系：神经球培养密度、培养基养分浓度和培养基与神经球之间的传质情况等都有一定程度的影响；但是坏死细胞核的出现主要取决于神经球的尺寸，过大的神经球内必定会出现坏死细胞核，即使在生物反应器中良好的外部培养条件下也不可能抑制它的出现。此外，神经球内由于氧缺乏而形成的坏死细胞核的出现要早于由于葡萄糖缺乏时的情况，并且坏死细胞核一旦出现，其增长速度就非常快，有可能很快使整个神经球成为坏死细胞球。本文所建立的元胞自动机（Cellular automata，CA）模型及各种生物反应器培养条件下神经球内的传质模型可以很好的模拟神经球的生长过程。     

同种异体胚胎神经干细胞移植修复脊髓损伤的时效性观察

目的:观察同种异体胚胎神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠双后肢运动功能的修复作用,并分析其移植时效性。方法:实验于2003-07/08在大连医科大学分子生物学实验室和大连理工大学环境与生命学院生物医学实验室完成。①取孕14￣16d的大白鼠1只,引颈处死,剖腹,取出胎鼠,钳取大脑皮质及皮质下脑室旁的脑组织,体外培养大鼠胚胎神经干细胞。②将30只成年SD大鼠按随机数字表法分为3组,即损伤对照组、早期移植组和延期移植组,每组10只。3组大鼠均制作脊髓横断损伤模型,造成大鼠下肢瘫痪,早期移植组、延期移植组大鼠分别在伤后3d及3周移植胎鼠脑组织神经干细胞。观察移植后大鼠双后肢的运动功能恢复情况,通过胶质原纤维酸性蛋白及神经元特异性烯醇化酶免疫组化染色法观察各组大鼠的脊髓组织形态学变化,胶质原纤维酸性蛋白是星形胶质细胞特异性标志蛋白,神经元特异性烯醇化酶是神经元特异性蛋白。结果:脊髓损伤建模实验纳入大鼠30只,全部进入结果分析,无脱失。①各组大鼠神经干细胞移植后双后肢的功能恢复情况:早期移植组和延期移植组大鼠双后肢的运动功能均有明显改善,但早期移植组表现尤为显著。早期移植组和延期移植组细胞移植后五六天即可见瘫痪大鼠的后肢肌力开始恢复,二三周后可出现爬行,4周后后肢活动活跃;损伤对照组大鼠的瘫痪肢体无任何恢复。②移植4周后早期移植组大鼠移植区脊髓组织的形态学变化:脊髓移植区肉眼可见有增生的组织充填,镜下有大量新生的细胞,表现为神经元和神经胶质细胞阳性染色(胶质原纤维酸性蛋白( ),神经元特异性烯醇化酶( ))。结论:神经干细胞移植对脊髓横断大鼠运动功能恢复有促进作用,早期移植疗效更好。     

成骨细胞不同体外培养方式的耗氧速率检测

背景:近年来组织工程种子细胞结合微胶囊技术在细胞治疗、基因治疗和药物控制释放等方面的应用越来越广泛,检测成骨细胞的耗氧量和耗氧速率,可为成骨细胞在不同培养模式中的体外培养、扩增和工程化骨组织的三维构建以及以上方面的实验提供相关的理论依据.目的:实验拟对比成骨细胞在体外静态直接培养和包囊培养两种不同方式中的耗氧量和耗氧速率.设计、时间及地点:对比观察,于2007-03109在大连理工大学精细化工国家重点实验室于细胞与组织工程研发中心完成.材料:出生二三天SD大鼠10只,SPF级,雌雄不拘:海藻酸钠溶液购自天津远航化学品有限公司.方法:无菌条件下取大鼠颅骨,剔净后剪成1 mm×1mm碎组织块,经2.5 g/L胰蛋白酶溶液和1g/L Ⅱ型胶原酶溶液分别消化后,加入含体积分数为0.1小牛血清的DMEM培养基,调节细胞浓度为109 L-1后接种在T-25培养瓶内.取二三代细胞分别接种子培养瓶中直接静态培养和经海藻酸钙微胶囊包囊后培养.主要观察指标:倒置相差屁微镜下观察成骨细胞在静态培养瓶中和包囊培养过程中的黏附、伸展、分布情况,并测定细胞生长曲线.检测成骨细胞的生物学性能及不同体外培养方式中成骨细胞消耗氧的速率.结果:①原代培养的成骨细胞为贴学生长,形态多为梭形或多边形.经包囊培养后成骨细胞在海藻酸钙微胶珠中呈圆形,细胞分布均匀.②体外培养的成骨细胞各种生物学性能良好.③体外静态培养瓶与包囊培养效果良好,耗氧速率分别为5.56×10-6μmol/min 和 1.25×10-4 μmol/min.结论:体外静态直接培养的耗氧量和耗氧速率高于包囊培养法,体外静态培养与包囊培养的成骨细胞各种生物学性能都良好,适于作为组织工程的种子细胞进行下一步的实验.     

同种异体胚胎神经干细胞移植修复脊髓损伤的时效性

背景:研究表明神经干细胞在脊髓损伤中具有潜在的治疗作用,但何时移植效果较好?目的:观察同种异体胚胎神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠双后肢运动功能的修复作用,并分析其移植时效性.设计:观察对比实验.单位:大连医科大学分子生物学实验室和大连理工大学环境与生命学院生物医学实验室.方法:实验于2003-07/08在大连医科大学分子生物学实验室和大连理工大学环境与生命学院生物医学实验室完成.[1] 取孕,14～16d的大白鼠1只,引颈处死,剖腹,取出胎鼠,钳取大脑皮质及皮质下脑室旁的脑组织,体外培养大鼠胚胎神经干细胞.[2]将30只成年SD大鼠按随机数字表法分为3组,即损伤对照组、早期移植组和延期移植组,每组10只.3组大鼠均制作脊髓横断损伤模型,造成大鼠下肢瘫痪,早期移植组、延期移植组大鼠分别在伤后3d及3周移植胎鼠脑组织神经干细胞.观察移植后大鼠双后肢的运动功能恢复情况.神经干细胞移植4周后,取出移植区脊髓,作切片进行免疫组织化学染色,观察比较各组大鼠的脊髓组织形态学变化.实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求.主要观察指标:[1]各组大鼠神经干细胞移植后双后肢的功能恢复情况.[2]神经干细胞移植4周后各组大鼠脊髓移植区的组织形态学变化.结果:脊髓损伤建模实验纳入大鼠30只,全部进入结果分析,无脱失.[1]各组大鼠神经干细胞移植后双后肢的功能恢复情况:早期移植组和延期移植组大鼠双后肢的运动功能均有明显改善,但早期移植组表现尤为显著.早期移植组和延期移植组细胞移植后五六天即可见瘫痪大鼠的后肢肌力开始恢复,两三周后可出现爬行,4周后后肢活动活跃;损伤对照组大鼠的瘫痪肢体无任何恢复.[2]移植4周后早期移植组大鼠移植区脊髓组织的形态学变化;脊髓移植区肉眼可见有增生的组织充填,镜下有大量新生的细胞,表现为神经元和神经胶质细胞阳性染色.损伤对照组肉眼见两断端间呈空腔状.镜下脊髓残端变性坏死明显,空泡变性等.延期移植组脊髓移植区的组织形态学变化介于早期移植组和损伤对照组之间,无典型的组织形态学变化特征,镜下有一定量的新生细胞,但数量较早期移植组明显少.结论:同种异体胚胎神经干细胞移植对脊髓横断大鼠运动功能恢复有促进作用,早期移植疗效更好.