黑色素瘤相关性抗原E1基因的克隆与测序

目的 克隆表达人黑色素瘤相关性抗原MAGE-E1片段，以便研究其对神经系统恶性肿瘤的生物学作用。方法 从人胶质瘤细胞系BT-325中提取mRNA，用RT-PCR法从中扩增出MAGE—E1片段，采用DNA重组技术将其克隆于pGEM—T Easy载体中并测序。结果 RNA体外扩增得到的片段为400bp，PGEM—MAGE-El经酶切鉴定正确，测序结果与Genebank比较完全相同。结论 该片段可用于真核及原核表达。     

人ALEX2部分cDNA序列的克隆与表达

目的：克隆人ALEX2基因部分片段的cDNA,构建重组表达载体并诱导其表达．方法：通过RT—PCR技术从人胚胎脑组织中特异扩增出ALEX2基因部分编码序列片断(630—1058位核苷酸),克隆入pGEM—Teasy载体中,测序后亚克隆于表达载体pGEX-4T-3中,酶切鉴定正确,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导4h后,可表达Mc417000的目的蛋白．结果：特异扩增出大小约440bp的片断,经测序与已知序列完全一致,构建了融合蛋白的重组表达质粒PGEX-ALEX2,表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测,占菌体总蛋白量的15．5%．结论：获得了人ALEX2部分基因编码片断及其原核表达产物,为下一步ALEX2 mAb的制备和研究其生物学功能奠定了基础．     

EGFR/HER2基因敲减对SPC-A-1细胞株细胞生物学特性及相关信号通路的影响

目的： 探讨EGFR/HER2基因沉默对非小细胞肺癌细胞株EGFR酪氨酸激酶信号转导通路的交互影响及其与细胞增殖、凋亡和周期改变的关系。方法： 设计并合成EGFR、HER2及 EGFR/HER2共干扰序列,构建含干扰序列的载体,进行瞬时转染;应用实时荧光定量、蛋白印迹法检测基因沉默效果;用四甲基偶氮唑盐比色法、流式细胞仪检测基因沉默后生物学特性改变;蛋白印迹法检测EGFR下游信号通路蛋白Akt、p-Akt、p-Erk1/2、p-p38表达水平变化;采用SPSS13.0软件分析结果。结果： 在SPC-A-1细胞系中,EGFR干扰组、HER2干扰组、EGFR联合HER2干扰组和EGFR-HER2共干扰组体外细胞增殖率均有下降趋势;除EGFR干扰外,其余各组均可诱发凋亡;各组的细胞周期G1期和S期细胞比例有显著改变;基因沉默效果检测显示EGFR和HER2基因蛋白水平被下调。下游信号通路蛋白检测示EGFR下游信号通路蛋白Akt、p-Akt、p-Erk1/2、p-p38表达水平和细胞增殖、凋亡以及细胞周期改变之间未发现明显相关规律。结论： 单纯EGFR干扰SPC-A-1细胞不能诱发显著凋亡,HER2和EGFR/HER2基因共沉默后诱发的人肺腺癌SPC-A-1细胞凋亡比阴性对照显著增加。EGFR/HER2基因沉默后诱发的细胞增殖、凋亡和细胞周期改变与EGFR家族下游信号通路蛋白之间未发现显著相关关系。     

VEGF-D基因在肺腺癌、吉非替尼继发耐药肺腺癌及正常肺组织中的表达

背景与目的 表皮生长因子酪氨酸激酶受体抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine inhibitor,EGFR-TKI)在治疗非小细胞肺癌中逐渐开始发挥重要作用,对EGFR-TKI继发耐药的机制亦日益受到关注.本研究旨在了解血管内皮生长因子D(vascular endothelial growth factor D,VEGF-D)基因在肺腺癌、吉非替尼继发耐药肺腺癌以及正常肺组织中的表达情况,以了解其在吉非替尼继发耐药中的作用.方法 取外科切除的肺腺癌组织及癌旁正常肺组织、吉非替尼继发耐药肺腺癌组织(包括转移的淋巴结).以β-actin为内参照,SYBR Green法实时定量PCR检测VEGF-D基因相对表达水平.确定阳性表达结果后,对表达率和表达水平进行定性和定量分析.结果 对吉非替尼继发耐药肺腺癌(1/6,16.7%)、肺腺癌(7/14,50.0%)和正常肺组织(16/16,100.0%)中VEGF-D基因表达率用计算确切概率值法比较后,三组样本VEGF-D的表达率有显著差别(P=0.000 091 7).7例VEGF-D基因表达阳性的肺癌组织VEGF-D表达水平经非参数检验显著低于对应的正常肺组织(P=0.000).结论 VEGF-D基因在正常肺组织中处于高表达状态,而在肺腺癌组织和吉非替尼继发耐药肺腺癌表达降低,说明其在肺癌及吉非替尼耐药肺癌组织所起的作用不同于正常肺组织.     

层粘连蛋白5和表皮生长因子受体在肺癌患者肿瘤组织中的表达关系

目的 探讨肺癌患者肿瘤组织中层粘连蛋白5（LN5）和表皮生长因子受体（EGFR）表达水平的关系，为EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）个体化靶向治疗提供依据。方法应用实时定量PCR方法检测了39例肺癌患者肿瘤组织LN5和EGFRmRNA表达水平，并分析二者之间的关系。结果 Pearson相关分析提示LN5和EGFR表达水平呈正相关（r=0．541，P〈0．0005）。线性回归分析提示EGFR随LN5表达水平的变化而变化，回归方程为：lgEGFR=2．202＋0．458lgLN5。结论 本研究提示LN5的表达水平和EGFR-TKI的靶分子EGFR的表达水平呈线性相关，LN5的低水平表达可能是肺癌中EGFR-TKI靶向治疗疗效的预测因子之一。本研究为EGFR-TKI的个体化靶向治疗提供了试验依据。     

基因扫描分析小鼠T细胞受体CDR3谱型检测T细胞克隆技术的建立

目的 建立小鼠T细胞受体(TCR)互补决定区3(CDR3)谱型的基因扫描分析术,为分析T细胞克隆提供研究方法.方法 应用RT-PCR方法分别扩增近交系小鼠C57BL/6H-2b,Balb/CH-2d和F1代小鼠[Balb/cx C57BL/6 F1H-2d/b,CB6F1)脾脏T细胞的21个TCK Va家族和18个TCK VB家族的CDR3,并用基因扫描分析扩增产物以确定T细胞的克隆性.结果 3种小鼠脾脏T细胞均表达所有的TCR Vα和Vβ CDR3基因,基因扫描显示全部TCK CDR3谱型呈高斯(钟型)分布,提示均为多克隆T细胞.各家族CDKs基因表达频率接近,但呈现不同的多态性和长度分布.结论 基因扫描分析TCR.αβ CDR3基因谱型是检测小鼠T细胞克隆性的精确敏感方法.     

HER-2基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以HER-2为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6/ GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定.再转染人大肠癌HT29细胞,进行荧光摄像和G418抗性筛选.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列.结论:HER-2靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,并可以进行稳定筛选.     

不同非小细胞肺癌细胞株中DNA-PKcs的表达及其与放射敏感性的关系

背景与目的：DNA依赖蛋白激酶催化亚基（DNA—dependent protein kinase catalytic subunit,DNA—PKcs）在电离辐射引起的DNA双链断裂的修复过程中起着关键作用,可影响组织细胞对放射治疗的敏感性。本研究通过检测DNA—PKcs在不同组织学类型非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）细胞中的表达情况,探讨其与放射敏感性的关系。方法：Western blot及DNA—PK活性分析法检测NSCLC细胞株A549、H1299、L78、PGCL3和H460中DNA—PKcs的含量与活性。成克隆实验分别测定各细胞株照射后的剂量一存活曲线,并分析放射敏感性与DNA—PKcs的关系。结果：成克隆实验结果显示：不同NSCLC细胞株的放射敏感性不同,A549细胞2Gy剂量照射下的存活分数（survival fraction at 2Gy,SF2）为0．74,H1299细胞为0．25,H460细胞为0．21,PGCL3细胞为0．48．L78细胞为0．58。Western blot显示各NSCLC细胞株中DNA-PKcs的表达有差异．A549细胞的DNA—PKcs表达水平为3．26±0．98,L78细胞为0．51±0．07,H1299细胞为0．51±0．11,H460细胞为0．86±0．23,PGCL3细胞为2．60±0．76。A549细胞的DNA—PKcs活性为8．30±1．03,H1299细胞为2．45±0．52,H460细胞为0．11±0．02。PGCL3细胞为4．13±0．87．L78细胞为0．42±0．07。在腺癌及大细胞癌中SF2与DNA—PKcs含量（P〈0．05,r=0．95）及活性（P=0．03,r=0．98）呈线性相关。结论：在腺癌及大细胞癌中．DNA-PKcs是判断细胞放射敏感性的重要因素。     

MAGE-3基因的表达、纯化及其抗血清的制备

[目的]构建MAGE-3的原核表达质粒,表达、纯化蛋白并制备多克隆抗体.[方法]利用RTPCR方法扩增MAGE-3基因片段,连接入原核表达载体pGEX-4T-1,构建MAGE-3的原核表达质粒pGEXMAGEE-3并测序.将该质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,并通过谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统进行分离纯化.用纯化的融合蛋白GST-MAGE-3免疫新西兰大白兔,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western-blot检测抗体活性.[结果]构建了pGEX-MAGE-3原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后表达一相对分子质量约为72×103的蛋白,经GST融合蛋白纯化系统纯化,得到了MAGE-3的重组蛋白GST-MAGE-3.制备了兔抗GST-MAGE-3抗体.Western blot证实该抗体可与GST-MAGE-3蛋白特异性结合.[结论]获得了肿瘤抗原MAGE-3的纯化重组蛋白及其特异的多克隆抗体、为进一步研究MAGE-3抗原在肿瘤免疫治疗中的作用提供了一件检测工具.     

表皮生长因子受体抑制剂吉非替尼诱导人表皮角质细胞凋亡的研究

目的:探讨表皮因子受体抑制剂吉非替尼对分离培养的人表皮角质细胞的生长抑制及其诱导凋亡的作用机制,为探寻其对皮肤的毒副作用机制奠定基础.方法:采用分散酶分离表皮细胞,无血清培养法进行表皮细胞的培养,MTT法检测吉非替尼对角质细胞生长的影响,Annexin V-FITC/7-AAD双染流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blotting检测Bcl-2、bim的变化,采用caspase-3 试剂盒检测caspase-3活性的变化.结果:以分散酶分离法成功得到8例人角质细胞,吉非替尼对人角质细胞生长有显著的抑制作用,并能显著诱导细胞发生凋亡,其作用呈明显的量效依赖性.吉非替尼能明显提高bim表达水平,促进caspase-3的活性.结论:吉非替尼通过调节Bcl-2家族蛋白及激活caspase-3诱导人角质细胞凋亡,抑制角质细胞增殖,这可能是其皮肤毒性的分子生物学基础.