人血清反应因子基因的原核表达及鸡卵黄多克隆抗体的制备

目的 在原核系统中表达人血清反应因子(serum response factor,SRF)基因,制备鸡卵黄抗SRF抗体并鉴定其特性.方法 构建SRF表达载体PGEX-T-2-SRF,并在大肠杆菌中以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达.表达产物经谷胱甘肽-S转移酶(glutathione-S-transferase,GST)亲和层析柱纯化后,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)进行鉴定.用纯化的SRF免疫海蓝白母鸡,制备鸡抗SRF抗体.抗体的效价及特异性用蛋白质印迹技术进行测定和分析,免疫荧光鉴定其在心肌细胞中的定位.结果 构建的重组质粒PGEX-4T-2-SRF在大肠杆菌中得到高表达,诱导表达的蛋白存在于包涵体和细菌裂解上清液中,纯化的SRF经SDS-PAGE鉴定呈单一条带.以纯化的SRF免疫制备了鸡抗SRF抗体.蛋白质印迹技术结果表明,该抗体可与原核表达的SRF特异性结合,抗体效价为1:5000.免疫荧光证实该抗体可以和心肌细胞的细胞核特异性结合.结论 在原核细胞中表达了SRF制备的鸡抗SRF的抗体对SRF能进行特异性结合.     

通过EGFR基因状态在肺泡细胞癌相关腺癌中的演变鉴别肺部系列病灶的起源——展示肿瘤进展

目的：肿瘤进展和第二原发癌的预后和处理策略迥异。本研究通过追踪同一肺泡细胞癌相关腺癌患者随着时间推移系列肿瘤标本EGFR突变状态的演变、肺泡细胞癌成分的变更以及和影像学、临床特征之间的关系，判别同一个体序贯出现的肿瘤标本来源于肿瘤进展还是第二原发癌（单一克隆还是肺内多原发起源）。方法：获取肺癌根治性切除及随访期间序贯出现的肺部病灶标本。通过直接测序和实时荧光定量PCR检测EGFR基因突变状态。结果：     

KG1a细胞体外诱导人外周血T细胞杀伤活性和TCR VβT细胞增殖的研究

【摘　要】　目的　了解急性髓系白血病KG1a细胞体外诱导人外周血T细胞的特异性细胞毒作用和T细胞受体(TCR) Vβ谱系表达和克隆性情况。方法　分别以Jurkat和Raji细胞作为阳性和阴性对照,建立TCR Vβ谱基因扫描技术,并用其检测5例健康个体T细胞克隆表型。采用混合淋巴细胞/肿瘤细胞培养方法,以照射后的KG1a细胞作为刺激原体外诱导外周血单个核细胞增殖,应用LDH释放法检测不同效靶比时诱导前后T细胞杀伤KG1a细胞的活性,同时利用基因扫描技术分析诱导后TCR Vβ亚家族的克隆性增殖特点。结果　基因扫描显示5例健康人全部TCR Vβ谱型均呈高斯(钟型)分布,各亚家族表达频率接近,但呈现不同的多态性和长度分布。KG1a细胞可以诱导出呈单克隆、寡克隆或寡克隆趋势生长的亚家族T细胞,并具有特异性识别和杀伤KG1a细胞的功能。结论　KG1a细胞在体外可诱导T细胞呈克隆性增殖,此优势增殖的克隆性T细胞具有特异性细胞毒作用,对KG1a细胞具有选择性杀伤作用。     

微波固化保肢术后成骨肉瘤患者红细胞免疫功能的变化

研究微波固化保肢术提高患者生存率的免疫学机制。方法应用色散比浊法检测患者血清Ｃ３、Ｃ４含量,应用红细胞Ｃ３ｂ受体花环、免疫复合物花环及直接肿瘤花环检测红细胞免疫功能。     

非小细胞肺癌人群中c-MET基因的扩增检测

目的：c-MET基因扩增是非小细胞肺癌对EGFR TKIs（吉非替尼或厄罗替尼）产生耐药的主要机制之一。本研究探讨没有接受TKIs治疗与TKIs治疗后耐药的NSCLC中c-MET基因的扩增是否存在差异。方法:获得55例术后非小细胞肺癌（NSCLC）的肿瘤组织（基线组）以及23例对TKIs耐药的肿瘤组织（耐药组）后,通过激光显微切割筛选癌细胞后提取基因组DNA,实时荧光定量PCR TaqMan探针法检测所有标本的c-MET基因的拷贝数。 结果:1.基线组和耐药组的临床病理特征均与c-MET基因的扩增无关。2.基线组中c-MET基因扩增阳性率为5.5% (3/55);耐药组的c-MET基因扩增阳性率为21.7% (5/23)。两组之间有统计学差异（Fisher精确概率法,P=0.045）。3.在7例获得TKI治疗前后肿瘤组织的NSCLC中,TKI治疗前没有出现c-MET的基因扩增,TKI治疗后有2例患者出现了c-MET的基因扩增（2/7）。TKI治疗前后的c-MET基因扩增差异无统计学意义。结论:NSCLC的临床病理特征不能预测c-MET基因扩增;在没有接受EGFR TKIs治疗的NSCLC中,c-MET基因扩增仅为少见事件。但经过吉非替尼或厄罗替尼治疗后出现耐药情况NSCLC中,部分患者的c-MET基因出现扩增。     

肝癌热休克蛋白—抗原肽复合物的构建及诱导CTL反应的初步研究

目的：研究体外构建热休克蛋白-抗原肽复合的方法,观察其在体外的抗肿瘤作用。方法：用经43℃热处理1小时的人肝细胞悬液,经过裂解液裂解,60%-80%饱和硫酸铵沉淀,用SephadexG-100柱制备,取分子量为70KD组份,Westen blot进行性质鉴定。应用多肽解离液处理该组份,SephadexG-25柱过滤获得未结合多肽的蛋白分子,使其在体外与肝癌抗原肽SLIVHLNEV结合,构建成热休克蛋白-抗原肽复合物。应用此复合物树突状细胞,激活同源外周血T淋巴细胞产生肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞（CTL）,应用MTT法检测其对T2细胞及肿瘤细胞的杀伤活性。结果：所得蛋白经电泳及Western blot进行蛋白分子量及性质鉴定为热休克蛋白70。SephadexG-25柱双分离法证实应用上述方法成功构建了肝癌热休克蛋白70-抗原肽复合物,用该复合物负荷树突状细胞在体外可以诱导出较强的肝癌抗原肽物特异性CTL,可以杀伤负荷有该肽的T2细胞及递呈该肽的肿瘤细胞系。结论：体外构建的热休克蛋白-抗原肽复合物可以增强抗原肽诱导CTL反应能力,热休克蛋白是良好的T细胞免疫佐剂,有可能在肿瘤疫苗治疗中发挥重要作用。     

吉非替尼治疗前后肺腺癌患者血清蛋白质谱的变化

背景与目的 表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)治疗晚期NSCLC患者最终都会出现耐药.本研究目的 是检测耐药前后血清蛋白质谱的变化,探索可能用于预测TKI治疗后出现耐药的血清预测因子.方法 收集9例晚期NSCLC患者接受吉非替尼(gefitinib)治疗前后自身配对的血清样本20份,即入组口服吉非替尼前及临床评价为疾病进展前两周所采集的外周血血清.所有的患者对吉非替尼的最佳总疗效评价为疾病稳定或部分缓解.所有样本用弱阳离子微珠进行预分离后.在Bruker AutoflTM基质辅助激光解析离子化-时间飞行质谱仪(MALDI-TOF-MS)上进行血清蛋白质谱检测.以ClinProTools(Version:2.1)软件进行数据采集分析.结果 自身配对分析发现有7个血清蛋白质表达水平在肺癌患者耐药前后的血清中有统计学差异.该7个血清蛋白质谱峰为3 242.09、8 690.36、2 952.64、3 224.04、1 450.51、1 887.8及3 935.73(m/z).有3个血清蛋白(3 242.09、2 952.64及3 224.04)在耐药血清中下调,其余4个血清蛋白(8 690.36、1450.51、1 887.8及3 935.73)则出现上调.结论 特定的血清差异蛋白可能与吉非替尼治疗有效患者在治疗过程中出现耐药相关.这些差异蛋白的特性及其与吉非替尼治疗耐药的分子机制有待进一步研究.     

脊髓髓内胶质瘤显微手术切除及survivin因子表达

目的 探讨脊髓髓内胶质瘤显微手术的临床效果及survivin因子在脊髓髓内胶质瘤组织中的表达及其临床意义。方法 采用显微外科技术切除髓内胶质瘤17例，其中室管膜瘤8例，星形细胞瘤9例。术后进行临床随访并定期复查MRI。运用免疫组织化学技术(SP法)检测髓内胶质瘤组织survivin因子表达。结果 髓内室管膜瘤8例，肿瘤全切除7例，次全切除1例。星形细胞瘤9例，肿瘤全切除3例，次全切除5例，部分切除1例。在8例室管膜瘤组织中的survivin因子阳性表达有2例，9例星形细胞瘤组织中survivin因子阳性表达有6例，其中2例中度阳性表达的患者随访均出现肿瘤颅内及椎管内播散种植。结论 髓内胶质瘤中室管膜瘤显微手术疗效满意。髓内星形细胞瘤组织survivin因子表达明显高于室管膜瘤，survivin中度阳性表达可能与肿瘤蛛网膜下腔播散种植有关。     

骨盆环区域骨肿瘤的外科治疗

目的：评价半骨盆截除术、内半骨盆切除体外灭活再植 或单纯旷景术、插入式微波天线阵列诱导高温原位灭活术治疗骨盆部肌肿瘤;部分切除术及前后联合入路局部乔除并辅助以局部单纯放疗或（和）置管持续灌注化疗术治疗骶骨肿瘤的效果。探讨骨盆环区域骨肿瘤的各种外科治疗方法的优缺点,以便更有效的治疗该部位肿瘤。方法：７ａ中外科治疗骨盆环区域各类良、恶性肌肿瘤１４６例,其中应用半骨盆截除术治疗晚期骨盆骨肿瘤４４例。方法