胚鼠室管膜及成鼠骨髓神经干细胞分离培养及分化鉴定实验研究

目的 :探寻胚鼠室管膜和成鼠骨髓分离培养神经干细胞 (NSC)的可行性。方法 :将分离的胚脑室管膜组织或成年骨髓细胞分别特殊培养。以细胞克隆及免疫细胞化学方法判断NSC增殖并鉴定NSC、神经元和神经胶质细胞。结果 :两种组织来源细胞在相应培养条件下NSC均有快速增殖。可得到具有长突起并建立有网状联系的神经元及胶质细胞。结论 :由胚鼠室管膜和成鼠骨髓诱导分化NSC是可行的     

一种连续获取大量高纯度小胶质细胞的培养方法

目的 建立一种简易、高产量高纯度的连续获得小胶质细胞的培养方法.方法 原代培养新生1～3 d Wistar大鼠大脑皮层中混合胶质细胞,第8～9天采用振摇法和玻璃吸管吹打法分离获得Yield 1小胶质细胞,按1∶2传代培养剩余贴壁的混合胶质细胞,分别继续培养10～12 d、12～14 d后应用同样方法获得Yield 2、Yield 3小胶质细胞;采用流式细胞仪分析所获小胶质细胞CD11b/c、CD45、CD80、CD86、GFAP的表达,免疫荧光染色和CCK-8法分别检测小胶质细胞CD11b/c的表达和增殖情况,应用扫描电镜观察其超微结构,应用吞噬红色乳胶微球实验评价其吞噬功能.结果 本实验所用培养方法连续稳定地获得了大量高纯度的小胶质细胞;流式细胞仪检测结果显示Yield 1与Yield 3小胶质细胞CD11b/c、CD45、CD80、CD86表达阳性;免疫荧光染色显示Yield 1、Yield 2、Yield 3小胶质细胞CD11b/c表达均阳性;CCK-8法结果显示3代小胶质细胞增殖活力相比较差异无统计学意义(P＞0.05);扫描电镜显示3代小胶质细胞形态均呈胞体饱满、胞突细长等细胞形貌特点.相同条件下Yield 1、Yield 3小胶质细胞之间吞噬功能比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 以本实验方法可以连续获得大量高纯度的小胶质细胞,且这些不同代次小胶质细胞的抗原表型、增殖活力及吞噬功能无明显差异,可为相关的实验研究提供细胞来源.

Abstract：

Objective To establish an easy culture method of successively getting high purity and yield of microglia. Methods Cortices of neonatal Wistar rats (1-3 days old) were employed in this experiment. The first-generation microglial cells were isolated from the mixed glial culture by mechanical means (gently shaking and blowing with pipette). After the mixed glial cells being passaged at a density third generations ofmicroglial cells were harvested. CD1 lb/c, CD45, CD80, CD86 and GFAP were employed as the identification markers in detecting the phenotypes and purity of different generation of microglial cells by scanning electron microscope and flow cytometry. Immunofluorescence staining and CCk8 vitality measurement were used to judge the expression of CD11b/c and detect the proliferation of microglia cells. Microglial phagocytotic function was evaluated by phagocytosis of fluorescent microspheres. Results High yield and purity of microglial cells were stably obtained in this experiment. CD11b/c, CD45, CD80 and CD86 positive expressions were noted in the first and third generations of microglial cells by flow cytometry; CD1 1b/c positive expression was noted in the first,second and third generations of microglial cells by immunofluorescence staining. No obvious differences in the 3 different generations of microglia cells were found on proliferation ability by CCk8 vitality measurement, and on morphology and phenotypes by scanning electron microscope; no obvious differences in the first and third generations of microglia cells were found on phagocytic ability (P＞0.05).Conclusion High yield and purity of microglial cells can successively obtain through the above method;no significant differences are noted among different generations of microglia cells on purity, morphology,phenotypes, proliferation activity and phagocytic ability.     

菲立磁胞内标记食蟹猴骨髓基质细胞

目的 探索利用菲立磁和转染试剂体外磁性标记食蟹猴骨髓基质细胞（BMSCs）方法的可行性。方法 无菌条件下取食蟹猴骨髓,梯度密度离心法分离获取BMSCs,使用菲立磁-多聚赖氨酸复合物（FE-PLL）标记BMSCs,普鲁士蓝染色、电镜和台盼蓝排除实验等方法鉴定FE-PLL标记食蟹猴BMSCs的效率和细胞的活力,倒置相差显微镜和免疫细胞化学方法检测BMSCs的增殖和分化能力。结果 菲立磁可以高效率地标记BMSCs,标记效率在99％左右。光镜和电镜下BMSCs胞质内分别可见细小的蓝色铁颗粒和许多包裹铁颗粒的囊泡。FE-PLL标记对BMSCs的活力、增殖和分化等能力没有明显的影响。结论 菲立磁可以用来体外标记食蟹猴BMSCs。     

兔骨髓基质细胞核移植的初步研究

目的 通过建立骨髓基质细胞核移植的方法，为进一步从克隆囊胚的内细胞团细胞分离培养出全能性的胚胎干细胞并用于治疗性克隆等研究奠定基础。方法 超排获得的兔成熟卵母细胞去核后，将同种的单个骨髓基质细胞核注入其内；电融合后，经离子霉素（ionomycin）和6-甲氨基嘌呤（6-DMAP）激活，用10％胎牛血清（FBS）的TCM-199进行体外培养直至囊胚阶段。结果 实验对147个卵母细胞去核，去核成功率为70．75％（104／147）；注核后有82．69％（86／104）的卵细胞保持形态完整；重构后的体细胞-卵母细胞质复合体经电融合后的融合率为56．79％（46／81）；激活后的重构胚于体外培养后分裂率为65．22％（30／46），囊胚率为17．39％（8／46），获得的囊胚有62．5％（5／8）进入孵化阶段；孵化出来的细胞贴壁生长并向周围扩展，显示了具有向下一阶段发育的潜能，为从囊胚内细胞团细胞中分离并培养出胚胎干细胞提供了可能。结论 实验结果表明，以兔成体体细胞的骨髓基质细胞为核供体，经克隆技术生产出囊胚并从中分离内细胞团细胞具有可行性。     

成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性研究

目的研究体外培养的成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性。方法对骨髓源性神经干细胞分别进行细胞形态学观察、刀豆球蛋白A凝集试验和双层软琼脂培养以探明其是否具有恶性转化细胞的形态特征、表面结构及生长特性的变化：利用免疫细胞化学的方法检测骨髓源性神经干细胞的端粒酶和肿瘤相关基因的表达：将骨髓源性神经干细胞接种到裸鼠体内观察其成瘤性。结果骨髓源性神经干细胞不具有恶性转化细胞的形态特征，在不同刀豆球蛋白A浓度下均未见明显的凝集反应，在双层软琼脂不能形成细胞克隆；骨髓源性神经干细胞的c-myc、c-fos和p53基因均呈阴性表达，而端粒酶逆转录酶呈弱阳性表达：将骨髓源性神经干细胞接种于裸鼠皮下6个月未见肿瘤形成，亦未见其它组织形成。结论骨髓源性神经干细胞保持了正常细胞的生物学特征．体内和体外的各项指标均未提示其具有致瘤性．体外的培养条件没有使其发生恶性转化．从致瘤性方面证实了骨髓源性神经干细胞临床移植的安全性。     

菲立磁标记大鼠骨髓基质细胞及自体移植后磁共振示踪的研究

目的初步探索利用菲立磁(Feridex)和转染试剂体外磁性标记大鼠骨髓基质细胞这一方法的可行性，为将来临床上应用磁共振成像(MRI)追踪标记细胞奠定基础。方法无菌条件下行股骨取骨髓，梯度密度离心法分离获取大鼠骨髓基质细胞，使用“Feridex-多聚赖氨酸复合物(FE-PLL)”标记骨髓基质细胞，采用普鲁士蓝染色、电镜和台盼蓝排除实验等方法鉴定FE-PLL标记大鼠骨髓基质细胞的效率和细胞的活力，并对FE-PLL标记骨髓基质细胞的增殖和分化能力进行评估。将FE-PLL标记和未标记后的骨髓基质细胞分别移植人大鼠左有侧尾壳核脑内．细胞移植后1、4、7周应用MRI对脑内移植的细胞进行活体示踪，最后利用组织切片进行普鲁士蓝染色。结果菲立磁可以高效率地标记骨髓基质细胞，标记效率在99%左右。普鲁士蓝染色显示FE-PLL标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。电镜结果显示FE-PLL标记的骨髓基质细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡。与正常未标记的细胞相比较，FE-PLL标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的影像。MRI检查发现脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变，未标记细胞侧脑组织无明显的低信号改变，与组织学切片结果基本相一致。结论以上结果提示菲立磁可以用来体外标记骨髓基质细胞，利用MRI技术可以对脑内移植后的标记细胞进行初步的活体追踪。     

人骨髓来源的多能成体祖细胞分离纯化的实验研究

目的 建立获取高纯度人骨髓来源的多能成体祖细胞(MAPCs)的方法。方法 取志愿者适量骨髓后采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞,对单个核细胞行贴壁培养后,将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45、Gly-A免疫做磁珠负分选,流式细胞仪鉴定分选后提高细胞纯度。结果 (1)通过MAPCs分选,半均每1×106／mL骨髓贴壁细胞可分选出约(5.1±2.8)×104／mL数量级的MAPCs,分选前后细胞活力分别为96.7％±1.7％和96.0％±2.4％,无明显差异;(2)流式细胞仪分析获取的CD45-、Gly-A-细胞纯度大于98％。结论 CD45、Gly-A免疫微磁珠负分选可从骨髓单个核细胞中中分选出高纯度的MAPCs。     

兔骨髓源性神经干细胞体外分化为神经元样细胞的功能特性研究

目的：检测由骨髓源性神经干细胞诱导分化而成的神经元样细胞，能否分泌γ—氨基酸(γ—aminobutyric acid，GABA)神经生物活性物质成分，从而初步推断是否具有神经元的生化特征。方法：无菌条件下抽取新西兰大白兔骨髓，梯度密度离心分离获取骨髓基质细胞(bone marrow stroma cells，BMSCs)，在神经干细胞培养基及脑源性神经营养因子(BDNF)等条件下，于体外诱导分化为神经干细胞及神经元样细胞，采用免疫细胞化学方法进行鉴定，并应用高效液相色谱法(HPLC)检测GABA生物活性物质的含量。结果：BMSCs培养12d可见细胞大而圆，免疫细胞化学检测巢蛋白抗原阳性；培养20d可见具有长突起的神经元样细胞形成，神经元核蛋白免疫细胞化学检查阳性，HPLC检测骨髓源性神经元样细胞含有高浓度GABA神经递质成分。方差分析显示：随着BMSCs培养天数的增加，其所含的GABA浓度也渐增加，由每1&;#215;10^7细胞中(3．43&;#177;0．25)μmol／L增至(14．69&;#177;3．51)μmol／L(F=23．69，P=0．0014)。结论：兔BMSCs在体外条件下可以增殖分化，前期表达Nestin，分化的细胞则可表达NeuN特异性抗体，并含有高浓度的类GABA神经递质成分。     

SD大鼠骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化的初步实验研究

以 SD大鼠为实验对象 ,从其骨髓分离出骨髓基质细胞 (BMSC) ,利用 L IF、b FGF、RA等增殖及分化诱导因子和神经干细胞培养液进行培养、分化诱导 ,观察 SD大鼠骨髓基质细胞体外培养的生长行为及扩增、分化情况。我们观察到 ,分离得到的骨髓基质细胞在体外培养中能形成细胞克隆团 ,这些具有克隆能力的骨髓基质细胞经传代后 ,其数量明显多于原代培养 ;BMSC经持续培养具有增殖能力以及分化为组织细胞的潜能 ,其分化细胞形态多样 ,包括胶质细胞样细胞和神经元样细胞。实验结果证明 ,骨髓基质细胞具有较强的自我更新的能力和多分化能力 ,也说明本实验所采用的细胞培养方法适用于骨髓基质细胞的体外生存与扩增。骨髓基质细胞较容易取材、体外培养和扩增 ,并具有多向分化潜能 ,在合适的诱导分化条件下 ,可分化出神经细胞 (神经元和神经胶质细胞 ) ,是理想的种子细胞     

利福平保护MPTP所致PD小鼠中脑多巴胺能神经元凋亡的实验研究

目的观察利福平(RFP)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)致帕金森病(PD) C57BL小鼠模型的神经保护作用。方法用MPTP建立C57BL小鼠PD模型,在应用MPTP前或后给予RFP,通过行为学观察、Nissl染色、免疫组织化学染色,观察RFP对PD小鼠模型的行为学表现及黑质致密部(SNc)Nissl、TH、Bcl-2、caspase-3阳性细胞的影响。结果小鼠注射MPTP后出现震颤、竖尾、竖毛、运动迟缓、步态不稳、肢体僵硬,活动明显减少,同时SNc的Nissl、TH阳性细胞明显减少,Bcl-2阳性细胞有所增多,caspase-3阳性细胞明显增多；应用RFP后较MPTP组症状减轻,Nissl、TH、Bcl-2阳性细胞增多．而caspase-3阳性细胞减少；预使用RFP组作用最为明显。结论RFP对MPTP所致的PD小鼠中脑多巴胺能神经元凋亡具有保护作用。