抑制p38 MAPK通路对大鼠癫痫发作引起海马神经元损伤的保护作用

目的探讨抑制p38 MAPK通路对减轻红藻氨酸诱导的颞叶癫痫发作引起大鼠海马神经元所造成损害的作用和机制.方法经侧脑室给予不同剂量(0,0.01,0,1,1 μg)SB203580(p38 MAPK特异性抑制剂)预处理,30 min后再予红藻氨酸制作大鼠颞叶癫痫持续状态模型.7 d后采用Nissl染色方法观察海马各区的锥体细胞和颗粒细胞的情况.结果红藻氨酸注射7 d后CA3区可见大量锥体细胞缺失,尚存细胞变性,伴局限性颗粒细胞增多,呈放射状分布.CA1区受累较轻,但也存在一定程度的细胞脱失.预先给予SB203580(0.1μg以上剂量)处理的动物以上变化明显减轻.假手术大鼠海马各区有大量正常致密锥体细胞,未见细胞脱失.结论大鼠侧脑室内注射红藻氨酸引起全身痉挛性癫痫持续状态对海马神经元造成损害,而抑制p38 MAPK通路,对海马神经元起一定保护作用.     

兔脊髓损伤不同时期的神经干细胞移植治疗的效果

目的:研究新西兰大白兔脊髓损伤后不同时期神经干细胞(neuralstemcells,NSCS)移植治疗的不同效果,探讨脊髓损伤移植治疗的最佳时机。方法:体外培养、诱导新西兰大白兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)为NSC并行5-溴-2-脱氧尿苷(bromodeoxyuridine/5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记。手术造成兔脊髓全横断模型,在术后即时,7,14,21,28d分别行NSC局部移植,同时设立脊髓全横断空白对照组,正常对照组。于移植后3个月观察动物脊髓损伤局部病理变化。结果:术后即时移植组局部仅有少量Brdu标记阳性细胞存活,通过脊髓损伤区的神经纤维数目少;7,14d移植组局部有大量Brdu标记阳性细胞存活,通过脊髓损伤区的神经纤维数目多,神经纤维排列较整齐;21,28d移植组局部有大量Brdu标记阳性细胞存活,但通过脊髓损伤区的神经纤维数目少,且再生的神经纤维排列紊乱;空白对照组未发现Brdu标记阳性细胞,在脊髓损伤区域未发现再生通过的神经纤维。结论:实验证明了脊髓损伤后7～14d为NSC最佳移植时期,同时提示NSC移植对动物脊髓损伤后的组织修复具有促进作用。     

骨髓源性神经干细胞去甲肾上腺素神经递质变化的实验研究

目的研究骨髓源性神经干细胞在体外培养及诱导分化条件下能否分泌去甲肾上腺素(NE).方法分离兔骨髓基质细胞(BMSCs),在体外应用神经干细胞培养液和诱导分化因子使其分化为神经干细胞及神经元样细胞,采用免疫细胞化学方法进行鉴定;应用高效液相色谱法(HPLC)检测其NE的含量.结果BMSCs培养7～14 d免疫细胞化学鉴定Nestin抗原阳性;培养20 d可见长突起神经元样细胞,神经核蛋白(NeuN)呈阳性表达;HPLC检测神经干细胞培养液及L-02肝细胞等阴性对照组及BMSCs(0～5 d)组未检测到NE,骨髓源性神经干细胞(培养7 d、14 d)及神经元样细胞(培养20d)均可检测到NE.随着培养天数的增加,所含的NE浓度也逐渐增加(P＜0.01).结论在适宜条件下,兔BMSCs可在体外分化成神经干细胞及神经元样细胞,并合成和分泌NE.     

神经巢蛋白抗原在兔骨髓源神经干细胞分化各阶段的表达

目的：检测神经巢蛋白抗原在兔骨髓基质细胞（hone marrow stromal cell，BMSCs)向神经细胞方向分化不同阶段的表达情况，为寻找骨髓基质细胞源性神经干细胞移植修复神经损伤最佳阶段提供体外实验依据。方法：以免BMSCs为实验对象，以“CYTOKINE&;#183;神经干细胞培养基”培养，并分作对照组胶质源性神经营养因子（GDNF，1μg/L)+维甲酸(0．5mg／L)组及“碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，10μg／L)组。免疫荧光细胞化学鉴定神经于细胞神经巢蛋白抗原、以流式细胞仪（FCM）鉴定分化各阶段表达神经巢蛋白的细胞比例结果。部分兔BMSCs在相应培养条件下分裂增殖为含粗大胞质颗粒的大圆形细胞，这些细胞表达神经巢蛋白，并能进一步分化成神经组织样细胞。FCM检测结果：经纯化的BMSCs中神经巢蛋白(+）细胞占了5．52％，随着分化的进行，在对照组分化第8天为1.56％，第16天为0．47％。GDNF+维甲酸组第8天为1.84％，第16天降至0.31％。而bFGF组，分化第8天神经巢蛋白(+）细胞比例升至6.18％，第16天则降至1．33％。结论：在以上实验条件下可诱导兔BMSCs向神经干细胞及神经组织样细胞转化的功能。在BMSCs向神经组织样细胞方向分化过程中，神经巢蛋白的表达呈下降趋势。而bFGF可使表达神经巢蛋白的细胞比例增高，可用千体外富集神经干细胞。     

红藻氨酸对海马CA1区突触传递的作用

目的研究激活海马红藻氨酸(kainate,KA)受体对CA1区兴奋性和抑制性突触递质的作用。方法对成年大鼠海马脑片CA1区锥体细胞采用“盲法”全细胞电压钳记录,分别检测和分析KA (10 μmol/L)对CA1传入纤维引出的兴奋性突触后电流和抑制性突触后电流的影响。结果KA受体的激活不仅显著性抑制抑制性突触后电流(P<0.01),而且同时显著性抑制兴奋性突触后电流(P<0.01)。结论KA受体通过激活同时抑制海马CA1区神经元兴奋性和抑制性突触的传入,对海马神经元动力学的平衡产生影响,从而促进癫痫的形成。     

P~(38)激酶在PC12细胞缺氧/再给氧损伤中的作用

目的:探讨PC12细胞缺氧/再给氧损伤的信号转导机理。方法:培养的PC12细胞先缺氧(95％N2/5％CO2)6h,然后重新给氧,观测不同时间点细胞的存活率和caspase-3的活性;用MTT法测存活率,caspase-3检测试剂盒测caspase-3活性。用p38拮抗剂SB203580孵育细胞2h,之后缺氧/再给氧,观察SB203580对细胞存活率和caspase-3活性的影响。结果:PC12细胞缺氧/再给氧后caspase-3活性明显增加并使细胞存活率下降,SB203580明显降低缺氧/复氧后caspase-3的活性并使细胞死亡减少。结论:PC12细胞缺氧/再给氧后至少可以通过激活p38、caspase-3信号分子诱导PC12细胞死亡。     

大鼠全骨髓细胞诱导分化神经细胞的实验方法研究

目的：摸索从全骨髓诱导培养分化神经细胞的方法，并从形态学上观察其演变规律。方法：抽取SD大鼠骨髓做全骨髓细胞培养．用光镜观察不同阶段的形态，荧光激活细胞计数仪(FACS)追踪由骨髓到神经元样细胞不同阶段nestin和Neuronal nuclei(NeuN)的表达趋势，给予定性、定量，以及免疫细胞化学鉴定。结果：骨髓细胞至10天开始分化，逐渐发育成为神经元样细胞。Nestin在15天时达到高峰为22．7％，NeuN于30天达到高峰为41．2％，而此时nestin阳性细胞为5．9％。免疫细胞化学鉴定出神经干细胞、神经元和胶质细胞，结论：建立了全骨髓细胞体外分离、培养的条件，具有简捷和高效的价值。     

微小磁珠法分离胚胎大鼠神经干细胞的实验研究

目的　旨在以微小免疫磁珠 (平均直径≤ 5 0 nm)分离提纯 SD大鼠胚胎大脑皮层组织中的神经干细胞并进行培养 ,观察细胞的增殖分化情况并对其分化产物进行鉴定 ,评价该分离方法的可行性及其在神经干细胞研究中的应用价值。方法　取 SD大鼠的胚胎大脑皮层组织制单细胞悬液 ,用微小磁珠分选出神经巢蛋白(nestin)阳性的细胞群 ,光镜下检测其纯度及活力后进行体外培养 ,特定条件下诱导分化并以免疫细胞方法检测产物的细胞类型。结果　分离的神经干细胞纯度为 (89.2± 4.8) % ,细胞存活率 (97.0± 1 .6) % ,诱导分化产物中出现 NSE阳性、GFAP阳性、巢蛋白 (nestin)反应阳性细胞群落。结论　微小磁珠法分离提纯神经干细胞纯度高 ,获得细胞数多 ,并对细胞的生物活性无明显影响 ,提纯的细胞可用于后续实验     

颈内动脉注射MPTP制作偏侧恒河猴帕金森病模型研究

目的探讨经颈内动脉注射MPTP制作偏侧恒河猴帕金森病模型的稳定技术和方法。方法对10只健康恒河猴注射MPTP,其中5只行颈外动脉夹闭,颈总动脉注射;5只行颈总动脉穿刺插管颈内动脉给药。其中1只模型动物在造模前后行正电子发射断层显像(PET)检查,观察脑代谢改变情况。对模型动物脑标本行快速冷冻切片,采用免疫组织化学方法检测多巴胺能细胞变化。结果采用颈总动脉插管颈内动脉注药建模均一次成功;2只颈外动脉夹闭颈总动脉注射药物建模一次成功,不成功的3只采用颈总动脉插管至颈内动脉再次注入相同剂量MPTP后建模成功。PET显示模型侧基底核区低代谢,与术前相比明显不同。免疫组化检测示模型侧中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞形态改变,数量减少,与对照侧有明显差异。结论与颈外动脉夹闭颈总动脉注射相比,颈总动脉插管颈内动脉注射MPTP制作偏侧恒河猴帕金森病模型更为简单有效。     

体外培养骨髓源性神经干细胞的细胞遗传学分析

目的评价体外培养的成人骨髓源性神经干细胞的遗传稳定性。方法制备骨髓源性神经干细胞的染色体标本，以常规染色和G显带进行染色体的核型分析。结果体外培养的成人骨髓源性神经干细胞的染色体数目为正常人类的46条染色体，未见非整倍体染色体像；G显带图像核型分析显示其为二倍体正常核型，染色体中未发现有缺失、倒位、易位、双着丝粒和环状染色体等结构异常。结论体外培养分化形成的骨髓源性神经干细胞保持了遗传学上的稳定性．为其进一步的临床应用提供了实验依据。