同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗创伤性脑损伤的遗传安全性评估

目的初步探讨同种异体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗创伤性脑损伤(TBI)的遗传安全性。方法 (1)体内实验:分离提取并传代培养雄性SD大鼠的BMSCs。将微量药物注射套管植入并固定于12只雌性SD大鼠左侧侧脑室3 d后, 用气压精密打击器对大鼠右侧大脑皮层进行打击以制备成中度TBI模型。分别于造模后4 h、3 d、6 d、9 d、12 d时经套管对TBI大鼠进行单次/多次BMSCs输注(2.5×105个/次, 总体积10 μL), 并分别取造模后48 h、72 h、10 d和14 d时TBI大鼠(每时间点3只)的脑组织制备成石蜡标本, 应用免疫荧光染色检测小胶质细胞激活情况, 应用RNAscope?技术检测星形胶质细胞、神经元、小胶质细胞与移植的BMSCs的共定位情况, 以观察同种异体BMSCs移植至TBI宿主体内后是否与宿主脑内细胞发生整合现象。(2)体外实验:先将冻存复苏的小胶质细胞株BV2用绿色荧光蛋白(GFP)阳性慢病毒颗粒转染, 再将pHrodo RED探针预标记的BMSCs与经脂多糖预处理的BV2细胞分别按一定比例(BV2∶BMSCs=1∶1、1∶2、2∶1)进行共...     

Up-regulation of the transient A – type K+ current (IA) in the differentiation of neural stem cells of the early postnatal rat hippocampus

Background Neural stem cells (NSCs) not only are essential to cell replacement therapy and transplantation in clinical settings, but also provide a unique model for the research into neurogenesis and epigenesis. However, little attention has been paid to the electrophysiological characterization of NSC development. This work aimed to identify that whether the morphological neuronal differentiation process in NSCs included changes in the electrophysiological properties of transient A-type K+ currents (IA). Methods NSCs were isolated from early postnatal rat hippocampus and were multiplied in basic serum-free medium containing basic fibroblast growth factor. Potassium currents were investigated using whole-cell patch-clamp techniques. Results Compared to NSC-derived neurons, cNSCs (cloned NSCs) had a more positive resting membrane potential, a higher input resistance, and a lower membrane capacitance. Part of cNSCs and NSC-derived neurons possessed both delayed-rectifier K+ currents (IDR) and IA, Steady-state activation of IA in cNSCs (half-maximal activation at 21.34±4.37 mV) occurred at a more positive voltage than in NSC-derived neurons at 0–6 days in vitro (half-maximal activation at 12.85±4.19 mV). Conclusions Our research revealed a developmental up-regulation of the IA component during differentiation of postnatal NSCs. Together with the marked developmental up-regulation of IDR in vitro neuronal differentiation we have previously found, suggest that the voltage-gated potassium channels may participate in neuronal maturation process.     

酸性成纤维细胞生长因子对大鼠创伤性脑水肿的防治作用

目的 观察酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）对创伤性脑水肿的作用。方法 大鼠脑损伤前应用aFGF持续脑室内注射12 h,观察脑含水量、病理组织学和超微结构改变。结果 脑水肿和神经细胞结构损伤明显减轻。结论 aFGF具有明显减轻脑水肿和神经细胞保护作用。     

菲立磁标记兔骨髓基质源神经干细胞自体移植入纹状体后的形态学观察

目的将体外标记的骨髓基质源神经干细胞经单细胞悬液微移植后观察其在兔纹状体的存活、迁移、分化和整合情况，为细胞移植治疗疾病奠定基础。方法分离兔骨髓基质细胞，利用神经干细胞培养基、白血病抑止因子和碱性成纤维母细胞生长因子进行细胞扩增并诱导成骨髓基质源神经干细胞，再经菲立磁和活细胞荧光染料PKH67标记后．采用微移植的方法，通过脑立体定位仪，用微玻璃针将干细胞分别植入兔脑纹状体内。存活1、4、8周后处死动物，组织切片，利用光镜和电镜观察标记细胞在脑内的形态学情况。结果菲立磁标记的兔骨髓基质源神经干细胞经微移植后可在兔脑内纹状体区域存活，移植的干细胞可向周围的脑实质内迁移和整合，迁移细胞沿特定的纹状体结构分布。少量菲立磁标记的干细胞可以分化成神经元。结论骨髓基质源神经干细胞移植后．可在脑实质内存活、迁移、分化和整合，这种细胞可能成为中枢神经系统自体移植的细胞来源。     

人骨髓基质细胞核移植重构胚的建立

目的建立人体细胞核移植技术，为治疗性克隆的实验研究及临床应用奠定基础。方法应用显微操作技术将单个人骨髓基质细胞注入去核后的兔卵母细胞内，经电融合、离子霉素和6．甲氨基嘌呤激活后．培养于含10％胎牛血清的TCM-199中，使重构胚进一步发育至囊胚。结果245枚卵母细胞进行去注核显微操作，核移植后有72．6％（178／245）卵母细胞仍保持完整；经电融合后细胞融合率为62．8％（83／132）：体外培养后约65％（54／83）的重构胚可进入分裂期，3．7％（2／54）发育至桑囊期，囊胚孵化率为100％（2／2）。结论兔卵母细胞能使人骨髓基质细胞核重新编程形成核移植重构胚并可继续发育至囊胚，使得从核移植重构囊胚分离胚胎干细胞用于实验和临床治疗研究成为可能。     

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

目的研究绿色荧光蛋白基因（Ad—GFP）腺病毒载体在人骨髓间充质干细胞（BMSCs）转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响．探讨用该载体构建基因修饰BMSCs的可行性。方法在体外分离培养人BMSCs，流式细胞仪检测细胞免疫表型，293细胞包装制备病毒，以不同滴度的Ad—GFP（1×10^3-1×10^10PFU／mL）转染BMSCs．细胞计数法分析转染率．倒置显微镜观察细胞形态学改变．CCK8法检测细胞增殖活性，用血清撤离加入β-巯基乙醇诱导转染Ad—GFP的BMSCs向神经元样细胞定向分化。结果3～6代BMSCs表面标志CD34、CD45呈阴性而CD29、CD44呈阳性：当病毒滴度为1×10^7PFU／mL时转染率为55％，1×10^9及1×10^10PFU／mL滴度时转染率均为85％，但1×10^10PFU／mL滴度时出现细胞病理现象；7d荧光表达最强，28d仍可见荧光表达。荧光显微镜下可见表达Ad—GFP的BMSCs有三种亚群结构：滴度≥1×10^6PFU／mL时，BMSCs增殖在早期受到抑制，且呈剂量依赖；转染Ad—GFP的BMSCs经β一巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞，神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性。结论合适滴度的Ad—GFP可以高效转染BMSCs，对细胞的生物学特性影响较小，不影响诱导分化功能，BMSCs可以作为用Ad—GFP载体系统进行基因治疗研究的种子细胞。     

猫骨髓源神经干细胞的诱导分化

目的观察家猫骨髓源巢蛋白阳性细胞诱导分化情况,为家猫骨髓基质细胞(BMSC)作为自体神经干细胞种子细胞提供理论依据。方法抽取家猫的骨髓,从中分离得到骨髓基质细胞,在体外给予神经干细胞培养基培养增殖,然后用分化诱导因子进行诱导分化,倒置相差显微镜下观察活细胞及免疫细胞化学染色情况。结果猫骨髓基质细胞在体外培养中体型增大,继之出芽,贴壁生长,可形成克隆团,同时可传代培养,这些具有克隆能力的骨髓基质细胞能表达神经干细胞特异性抗原巢蛋白,与5-溴尿嘧啶(BrdU)共培养3d后可见部分大圆形细胞BrdU染色阳性,这些细胞经进一步的诱导可分化为神经元样细胞,而且表达神经元特异性抗原NSE和NeuN。结论家猫骨髓基质细胞具有干细胞特征,可诱导为巢蛋白阳性细胞,并可进一步分化为表达烯醇化酶(NSE)和NeuN的神经元样细胞。证实家猫BMSC可作为移植修复神经系统损伤的神经干细胞种子细胞。     

菲立磁胞内标记食蟹猴骨髓基质细胞*

背景: 有关利用菲立磁体外细胞标记研究选择的动物主要是啮齿类动物,而研究灵长类动物食蟹猴的报道目前仍是空白。 目的：观察利用菲立磁和转染试剂体外磁性标记食蟹猴骨髓基质细胞方法的可行性。 方法：无菌条件下取食蟹猴骨髓,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞,使用菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞,普鲁士蓝染色、电镜和锥虫蓝排除实验等方法鉴定菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记食蟹猴骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,倒置相差显微镜和免疫细胞化学方法检测骨髓基质细胞的增殖和分化能力。 结果与结论：菲立磁可以高效率地标记骨髓基质细胞,标记效率在99%左右。光镜和电镜下骨髓基质细胞胞质内分别可见细小的蓝色铁颗粒和许多包裹铁颗粒的囊泡。菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显影响。提示菲立磁可以用来体外标记食蟹猴骨髓基质细胞。     

成人骨髓源性神经干细胞中nestin表达的实时定量RT—PCR检测

目的建立快速获取成人骨髓源性神经干细胞（Human adult bone marrow—derived neural stem cells,Md—NSCs）的方法,并对Md—NSCs中神经巢蛋白nestin的表达进行定量比较分析。方法抽取成人志愿者全骨髓,梯度离心分离成人骨髓基质细胞（human adult bone marrow stromal cells,hMSCs）,贴壁培养法纯化及扩增hMSCs;以神经干细胞培养基体外诱导培养hMSCs成为成人骨髓源性神经干细胞（Human adult bone marrow—derived neural stem cells,Md—NSCs）;以实时定量RT—PCR检测Md—NSCs中nestin基因的表达,以hMSCs作为对照组。结果hMSCs呈长梭形,贴壁生长,于体外诱导培养可快速有效地获取Md—NSCs,Md—NSCs不贴壁生长,由神经干细胞克隆组成神经球样结构;Md—NSCs中nestin基因的表达比hMSCs增高2．04×10^2倍。结论hMSCs经诱导分化成为Md—NSCs后细胞的生物特征发生显著改变,Md—NSCs高度表达神经巢蛋白nestin具有神经干细胞的特征,并非hMSCs的简单聚集成球。     

均一的成人骨髓源性神经干细胞的简捷获取

目的 探讨建立具均一性的、未分化且具有神经分化能力的成人骨髓源性神经干细胞（human adult bone marrow-derived neural stem cells,Md-NSCs）的有效获取方案。方法 抽取成人志愿者全骨髓,梯度离心分离成人骨髓基质细胞（human adult bone marrow stromal cells, hMSCs）,贴壁培养法纯化及扩增hMSCs;以神经干细胞培养基体外诱导培养hMSCs成为Md-NSCs,以诱导培养基于体外诱导培养Md-NSCs向神经系细胞分化;相差显微镜下观察 hMSCs及Md-NSCs的形态学特征;免疫组化法检测Md-NSCs中Nestin的表达,以及由 Md-NSCs诱导分化后得到的神经系细胞中GFAP、NG2及MAP2ab的表达。结果 传代纯化后的hMSCs呈梭形,贴壁生长,增殖旺盛。经10~15d诱导培养,hMSCs可分化为Md-NSCs,其形态为均一性的、呈球形的细胞克隆,不贴壁生长,增殖旺盛,并聚集成神经球结构,Md-NSCs克隆高度表达神经干细胞标志蛋白Nestin。经7~10天诱导培养,Md-NSCs于体外可分化成神经系细胞,分化细胞可表达星形胶质细胞标志蛋白GFAP、少突胶质细胞标志蛋白NG2及神经元细胞标志蛋白MAP2ab。 结论 通过本方案可简捷有效地获得均一的成人骨髓源性神经干细胞,可为体内移植治疗人类神经系统疾病提供丰富而理想的神经干细胞来源。