人骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的研究

目的：探讨人骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性，为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源。方法：无菌取成人髂骨骨髓，密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞(bone marrow stroual cells,BMSCs)；在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导为神经元样细胞，通过免疫细胞化学方法对诱导后细胞进行鉴定；通过高效液相色谱法(HPLC)检测诱导后细胞合成分泌神经递质去甲肾上腺素(NE)的能力。结果：分离得到的成人BMSCs培养10-14d后，细胞呈半贴壁状，胞体饱满，Nestin抗原染色阳性。培养20d后，在诱导因子作用下进一步分化为神经元样细胞(NLCs)，具有细长双极或多极突起，神经核蛋白(NeuN)抗原表达阳性。HPLC检测BMSCs、空白神经干细胞培养液未测到NE，经体外诱导培养8，11d的神经干细胞、体外诱导分化20d的NLCs均可检测到NE，神经干细胞(8，11d)的NE含量为(10．4146&;#177;1．0425)，(28．3359&;#177;3.8371)μg／L小于NLCs(20d)组(52．1342&;#177;3．9136)μg／L差异有非常显著性意义(F=126．64，P=0．0000)。而且随着BMSCs培养天数的增加，其所含的NE浓度也渐增加(P&;lt;0.05)。结论：在适宜培养条件及诱导因子联合作用下，人BMSCs可被成功诱导为神经细胞，并具有合成分泌神经递质成分的能力。     

不同浓度血清对大鼠骨髓基质细胞生长的影响

目的：探讨不同浓度血清对大鼠原代培养骨髓基质细胞(BMSCs)功能的影响，寻求培养所需的适宜血清浓度。 方法： 利用MTT法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪分析细胞生长周期及细胞凋亡的变化，PCR-ELISA法分析细胞端粒酶活性的改变。 结果： ①血清能明显促进BMSCs增殖，表现为G0/G1期细胞减少，S期细胞增加，群体细胞倍增时间缩短。②在组成BMSCs的Ⅰ型和Ⅱ型细胞发育生长过程中，血清对Ⅱ型细胞的增殖无明显促进作用；对Ⅰ型细胞，血清能明显促进细胞增殖。③短时间内血清对于BMSCs端粒酶活性无明显影响。 结论： ①对于BMSCs中不同类型的细胞采用的培养条件应因类而异。②血清对Ⅰ型细胞的增殖具有明显促进作用。③血清并不能促进Ⅱ型细胞增殖，但在短时间内对其分化亦无明显影响。     

来源于乳鼠与成年大鼠的脂肪源性干细胞增殖特性比较

目的 比较来源于出生5dSD乳鼠和成年SD大鼠的脂肪源性干细胞(ADSCs)在同等条件下进行培养时增殖情况的差异. 方法 分别分离乳鼠和成年大鼠皮下脂肪组织并使用Ⅰ型胶原酶消化法获取ADSCs,进行形态学观察.应用流式细胞仪检测ADSCs表面标记物CD45、CD29、CD90的表达情况,并在同等条件下接种相同数量的两种第2代ADSCs,培养4d后行细胞计数,比较ADSCs数量的差异.于96孔板上对相同数量的两种第2代ADSCs进行体外培养,应用CCK-8和alamar blue试剂盒连续7d对细胞增殖情况进行观察,酶标仪检测吸光度值,并绘制增殖曲线. 结果 流式细胞仪检测到来源于乳鼠和成年大鼠的ADSCs表面标志物均显示干细胞特性:CD45表达均呈阴性,CD29表达率分别是98.04％和93.17％,CD90表达率分别是94.92％和93.3％.在接种数量、培养条件和培养时间相同情况下,细胞计数结果显示,来源于乳鼠的ADSCs增殖数量[(8.87±0.13)×105]明显高于成年大鼠[(4.51±0.36)× 105].来源于乳鼠的ADSCs的吸光度值在第6、7天(CCK-8检测)和第2～7天(alamar blue检测)均明显高于来源于成年大鼠的ADSCs,比较差异均有统计学意义(P ＜0.05). 结论 来源于乳鼠的ADSCs比来源于成年大鼠的ADSCs增殖能力更强.     

光动力疗法对人脑胶质瘤细胞存活率影响的实验研究

目的:探讨5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)介导的光动力(ALA-PDT)对人脑胶质瘤细胞U251的治疗作用。方法:实验于2003-01/2004-05在解放军第一军医大学珠江医院全军神经医学研究所完成。将不同浓度的5-ALA加入到细胞培养基中,随之以激光辐照;固定浓度的5-ALA给予不同剂量的激光辐射。MTT法测定细胞存活率。结果:激光能量恒定于25.0J/cm时,ALA-PDT对U251细胞的杀伤力2在较低5-ALA浓度范围内,随着5-ALA的浓度的增高而增强。各组与对照组间相比较,差异均有显著性意义(F=770.12,P=0.0000)。在较高5-ALA浓度范围内,则存在着饱和现象;相同的5-ALA浓度下,细胞生存率随着激光能量的增加而下降。单用5-ALA或激光处理,均不对细胞造成显著杀伤。结论:5-ALA本身对细胞无明显毒性作用,其介导的PDT是很有前途的胶质瘤治疗方法。     

骨髓基质细胞分化为神经元样细胞后与皮质神经元间突触的建立

目的 观察与大脑皮质神经元共培养的骨髓基质细胞(BMSCs)经诱导分化成神经元样细胞后,与脑皮质神经元之间形成功能性突触的情况.方法 无菌条件下取绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓,用贴壁筛选法体外培养获得GFP转基因小鼠BMSCs(GFP-GM-BMSCs),在体外培养、扩增、纯化.取第3代GFP-GM-BMSCs,种植到源于小鼠大脑的原代皮质神经元和胶质细胞中,培养介质为加有20 ng/mL表皮生长因子(EGF)、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基(Neurobasal-A+2%B27),体外模拟建立细胞移植的共培养体系.共培养第10天,利用FM1-43荧光染料染色活动突触小泡的特性,通过荧光显微镜观察共培养的两种细胞之间形成的突触.结果 与神经元共培养的GFP-GM-BMSCs在含有EGF、bFGF的无血清培养基中7 d后分化为神经元样细胞.共培养10 d后,FM1-43染色阳性的突触囊泡明显增加,主要位于神经元样细胞胞体、突起及其末端结构上.结论 在体外模拟细胞移植共培养体系中,分化自GFP-GM-BMSCs的神经元样细胞能与神经元之间形成突触样连接.     

红藻氨酸作用后海马神经元胞膜表面的超微结构的原子力显微镜观察

目的观察原代培养神经元在红藻氨酸(KA)作用下细胞表面形态的三维构像变化。方法利用原子力显微镜(AFM)对大鼠海马神经元经不同浓度的KA(25和250 μmol/L,50和100 nmol/L)分别作用10 min和100 min后的表面结构进行纳米级水平扫描和观测。结果正常海马神经元表面光滑,起伏均匀、规律;KA作用后神经元呈退行性改变, 表现为胞体肿胀,胞膜表面粗糙,出现隆起和“孔洞”样结构,并且其变化程度分别与作用时间和KA浓度呈量-效关系。结论KA对海马神经元毒性作用后胞膜表面超微结构所产生的明显变化,可借助AFM清晰观察,并定量分析。     

人骨髓基质细胞作为核移植供体细胞的相关生物学特性研究

目的研究作为核移植供体细胞的人骨髓基质细胞相关生物学特性。方法应用密度梯度离心法分离培养人骨髓基质细胞，并对其进行形态观察、免疫荧光分析细胞骨架结构、端粒酶活性测定、核型及细胞周期分析。结果培养的细胞具有正常的大小、形态、细胞骨架结构：在融合密度达80%-90%时，G0＋G1期细胞所占的比例较高，约占92．58％；检测传至第7代的人骨髓基质细胞具有正常染色体数目（46，XY），端粒酶活性为0．567。结论形态良好、染色体数目正常的人骨髓基质细胞可以作为核移植的供体细胞。     

骨髓源性神经干细胞自体移植海藻酸致痫大鼠海马后脑电图的改变

目的探讨骨髓源性神经干细胞移植至海藻酸（KA）致痫大鼠海马后对宿主海马脑电图的影响，从而为神经干细胞移植治疗颞叶癫痫提供理论依据。方法无菌条件下分离大鼠骨髓基质细胞，在特定的条件下培养使其诱导分化为神经干细胞。建立大鼠颞叶癫痫模型，将诱导分化的神经干细胞自体移植至KA大鼠的右侧海马内，观察移植后1周、2周、4周、8周和16周大鼠海马的MRI和脑电图改变情况。结果MRI检查发现在神经干细胞移植后1周和2周时低信号改变区比较局限，但移植4周、8周和16周后低信号改变明显增大，且随着时间的推移低信号改变区逐渐增大。与未移植组相比，移植组大鼠海马脑电图的波幅明显降低，且随着时间的推移降低幅度也明显增加，最高至移植8周后脑电图波幅降低达40％以上。结论骨髓源性神经干细胞自体移植至KA大鼠后对宿主海马的癫痫样放电有一定的抑制作用。     

立磁胞内标记食蟹猴骨髓基质细胞

背景: 有关利用菲立磁体外细胞标记研究选择的动物主要是啮齿类动物,而研究灵长类动物食蟹猴的报道目前仍是空白.目的:观察利用菲立磁和转染试剂体外磁性标记食蟹猴骨髓基质细胞方法的可行性.方法:无菌条件下取食蟹猴骨髓,梯度密度离心法分离获取骨髓基质细胞,使用菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记骨髓基质细胞,普鲁士蓝染色、电镜和锥虫蓝排除实验等方法鉴定菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记食蟹猴骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,倒置相差显微镜和免疫细胞化学方法检测骨髓基质细胞的增殖和分化能力.结果与结论:菲立磁可以高效率地标记骨髓基质细胞,标记效率在99%左右.光镜和电镜下骨髓基质细胞胞质内分别可见细小的蓝色铁颗粒和许多包裹铁颗粒的囊泡.菲立磁-多聚赖氨酸复合物标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显影响.提示菲立磁可以用来体外标记食蟹猴骨髓基质细胞.     

脑胶质瘤差异表达基因的微矩阵研究

目的 用生物芯片筛选胶质母细胞瘤相关基因。方法 采用一种由包括胶质瘤cDNA文库构建的14 000个基因片段的生物芯片来杂交筛选胶质母细胞瘤的基因并分析其表达谱的变化。结果 经过杂交筛选并与正常脑组织比较,94个基因差异表达超过3倍,298个基因片段超过2倍。一些胶质瘤中上调基因在正常脑组织中几乎没有表达。几个与胶质瘤发生发展相关的新基因被证实。结论 生物芯片结合相关的cDNA文库对大规模快速筛选胶质瘤及其他肿瘤的治疗靶基因具有实际意义。