雷帕霉素通过抑制mTOR信号延长成年雌性大鼠卵巢的寿命

目的探讨雷帕霉素对成年雌性大鼠卵泡发育及卵巢寿命的影响,并研究mTOR信号在其中的作用。方法将16只8周龄雌性SD大鼠随机分为对照组和雷帕霉素干预组,观察两组大鼠动情周期的变化;10周后取大鼠卵巢,组织切片经苏木精-伊红染色,计数不同发育阶段的各级卵泡数;用蛋白免疫印迹（Western-blot）检测卵巢中mTOR和其磷酸化的靶分子S6K的蛋白表达水平。结果雷帕霉素干预组大鼠健康卵泡数（225.0±16.2）显著多于对照组（178.4±5.3）,差异有统计学意义（P〈0.05）。其中原始卵泡数（132.5±13.7）是对照组（59.6±5.2）的2倍多,而窦状卵泡和闭锁卵泡数则明显低于对照组,差异均有统计学意义（P〈0.01）。雷帕霉素干预组mTOR和P-P70S6K蛋白表达水平明显低于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论雷帕霉素可能通过抑制mTOR信号,从而抑制原始卵泡向发育卵泡转化,保存原始卵泡储备,由此使卵巢的寿命延长。     

一种简便的非同位素原位杂交方法

介绍一种简便的原位杂交方法，该方法操作简便、易行，在检测多拷贝基因组时具有一定的敏感性，同时兼有组织形态保持较好，背景干净的优点，比较适合于临床病毒病原体的检测。     

复方中药"克瘤宁"对人食管癌的抗癌作用及其机理研究

目的:探讨复方中药“克瘤宁”对人食管癌的抗癌作用及其机理。方法:①应用光镜、透射电镜,观察复方中药“克瘤宁”诱导人食管癌细胞株EC109细胞凋亡的作用;②用“克瘤宁”对移植人食管癌8d后的裸鼠进行治疗,实验共分五组:“克瘤宁”高浓度组(2.4g/kg)、中浓度组(1.2g/kg)、低浓度组(0.6g/kg)、阳性对照组(平阳霉素15mg/kg)和阴性对照组(生理盐水)。“克瘤宁”灌胃给药,每天一次,连续给药36次,平阳霉素腹腔注射给药,每3d一次,共给药12次。实验重复二次。结果:①经“克瘤宁”处理的EC109细胞出现典型的细胞凋亡特征;②克瘤宁高、中、低三剂量在裸鼠体内对食管癌的抑瘤率分别为:66.36%~76.85%(P<0.01)、54.21%~55.56%(P<0.01)、38.32%~39.81%(P<0.01),阳性对照平阳霉素在裸鼠体内对食管癌的抑瘤率为51.40%~56.48%(P<0.01)。结论:①“克瘤宁”有诱导人食管癌细胞产生凋亡的作用,这可能是“克瘤宁”抗食管癌作用的重要机理;②在裸鼠可耐受的剂量下,“克瘤宁”对裸鼠移植的人食管癌有明显抗癌作用,且随着剂量增加,其抗癌疗效增加。     

人食管鳞状细胞癌裸小鼠移植瘤模型建立及其应用研究

将人食管癌手术标本直接移植于裸小鼠，建立了人食管鳞状细胞癌裸小鼠移植瘤（Eca910709），其光镜和电镜形态与原发瘤相似。移植瘤中检测到人Alu序列，证明其来源于人体。应用Eca910709，用平阳霉素（BLMA5）对其进行治疗，按15mg／kg腹腔注射给药，经重复实验，抑瘤率为58％-70％（P＜0．01），说明BLMA5对Eca910709有明显的抑瘤作用。经三个疗程治疗，Eca910709即对BLMA5产生耐药，表现在抑瘤从70％（P＜0．01）递减为34％（P＜0．05）和6％（P＞0.05）。给药剂量增加至30mg/kg，BLMA5对已耐药的Eca910709再次显示一定的抑瘤作用（抑瘤率为44％，P＜0．01）。     

中药华泰八宝丹抗癌作用的研究

华泰八宝丹是一种纯中药制剂，用不同剂量对移植性肉瘤S-180Ehrlich腹水癌和恶性淋巴瘤腹水型LI的小鼠进行治疗，按体表面积计算给成人剂量的10倍、5倍和2.5倍，灌胃给药，经重复实验结果：肉瘤S-180抑瘤率三剂量分别为46%、61%、70%；小鼠生命延长率；Ehrlich腹水癌小鼠高剂量为40%，恶性淋巴瘤腹水型LI中、高剂量为35%和51%，对照阳性药物抑瘤率或生命延长率在25%-48%之间，以上数据经统计学处理，有显著意义或非常显著意义。说明本药有一定抑瘤作用，在小鼠可耐受的剂量下，剂量增加抑瘤效果增加。     

新生鼠卵巢FOXO3a表达水平与卵母细胞凋亡的相关性初步研究

目的:探讨新生大鼠卵巢中FOXO3a(forkhead box groupO)转录因子表达水平与卵母细胞凋亡的相关性。方法:取出生后2d、3d、8d、15d龄大鼠的卵巢,用免疫组化方法观察FOXO3a、caspase-3在卵巢组织中的定位及表达水平,且用TUNEL技术检测卵巢内卵母细胞的凋亡变化。结果:FOXO3a在新生大鼠部分卵母细胞巢内的卵母细胞核内高表达,而在卵泡发育启动后,FOXO3a则从卵母细胞的核内逐渐转移至胞浆。而在次级和成熟卵泡的卵母细胞内,FOXO3a仅出现在胞浆内。≤8d龄大鼠卵巢的部分卵母细胞核内或胞核、胞浆内可检测到caspase-3表达,2d、3d龄大鼠部分卵母细胞核内高表达。TUNEL染色与caspase-3结果相似,2d龄大鼠卵巢的卵母细胞阳性率最高。结论:生后2d大鼠卵巢的卵母细胞存在一个凋亡高峰期;在原始卵泡形成前,FOXO3a在部分卵母细胞核内高表达,并与卵母细胞的凋亡率呈一致性。     

Foxo3a转录因子参与卵母细胞的凋亡

目的 进一步探讨新生大鼠卵巢中Foxo3a（forkhead box group O）转录因子参与卵母细胞凋亡的调节机制。方法 取出生后1、2、3和4d龄大鼠的卵巢,用免疫组化方法观察Foxo3a、Bim和FasL在卵巢组织中的表达水平以及细胞定位,并且应用TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）技术检测卵巢内卵母细胞的凋亡变化。结果 免疫组化显示Bim和FasL都在新生大鼠部分卵母细胞巢和原始卵泡的卵母细胞核内和胞浆高表达,且阳性率曲线都在2d达到高峰,随后逐渐降低,与TUNEL和Foxo3a的阳性率变化曲线一致。然而Bim和FasL的阳性率都低于Foxo3a的阳性率。结论 Foxo3a可能同时诱导Bim和FasL的表达从而调节卵母细胞的凋亡。     

克隆并应用计算机软件分析小鼠LASS1基因启动子区的特征

目的:克隆并应用计算机分析小鼠LASS1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控奠定基础。方法:实验于2006-03/07在汕头大学医学院细胞衰老实验室完成。培养EC109细胞株,预测小鼠LASS1基因启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,构建重组质粒pGEM-T-501、pGEM-T-181、pGEM-T-26,并转化JM109感受态菌,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,酶切pGEM-T-501、181、26重组质粒及pGL3-Basic、pEGFP-1载体,制备插入片段和载体,构建重组表达质粒pGL3-501、pGL3-181和pGL3-26及pEGFP-501、pEGFP-181和pEGFP-26,转化JM109感受态菌。用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果:①在预测启动子区构建了3种荧光素酶报告基因表达体系及3种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系,分别为pGL3-501(-501bp～ 106bp)、pGL3-181(-181bp～ 106bp)、pGL3-26( 26～ 106)、pEGFP-501、pEGFP-181和pEGFP-26。②pGL3-501表达载体与pGL3-181表达载体荧光素酶表达活性相近,pGL3-26表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近, 26bp～ 106bp无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-501和pEGFP-181有明显的绿色荧光蛋白表达,pEGFP-26和空载体pEGFP-1无表达活性。结论:-181bp～ 26bp区域含有小鼠LASS1基因转录所必需的基本启动子序列。其中2个SP1保守序列是小鼠LASS1基因启动子所必需的。     

阴道毛滴虫LAG1基因启动子区克隆及分析

本研究旨在克隆并分析阴道毛滴虫LAG1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控提供实验资料。预测启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,然后测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明在构建的6种荧光素酶报告基因表达体系及2种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系中,表达载体pGL3-455(-455~ 55bp)、pGL3-417(-417~ 55bp)、pGL3-280(-280~ 55bp)、pGL3-202(-202~ 55bp)、pGL3-81(-81~ 55bp)的荧光素酶表达活性相近,均明显高于表达载体pGL3-47(-47~ 55bp)荧光素酶表达活性,而pGL3-47表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近,提示-47~ 55bp区无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-81(-81~ 55bp)有明显的绿色荧光蛋白表达,而pEGFP-47(-47~ 55bp)和空载体pEGFP-1未见表达。因此-81~-47bp区域含有阴道毛滴虫LAG1基因转录所必需的基本启动子序列。