外胚叶发育不全基因及其受体在斑马鱼牙齿早期发育中的表达

目的 探讨外胚叶发育不全（EDA）基因及其受体（EDAR）基因在斑马鱼早期咽齿发育过程中的表达模式,为进一步研究其在牙齿发育过程中的功能奠定基础。方法 提取受精后48 h（48 hpf）的斑马鱼胚胎总RNA,之后逆转录合成cDNA,以该cDNA为模板,特异性扩增斑马鱼咽齿特异性标记基因dlx2b、Eda信号通路相关基因eda及edar基因片段,用TA克隆试剂盒将这3个基因片段分别连接到pGEMT载体上,将对应质粒用聚合酶链反应（PCR）线性化,以PCR线性化做模板,选择相应的RNA聚合酶体外转录,合成dlx2b、eda及edar基因的反义mRNA探针。收集36、48、56、60、72、84 hpf的斑马鱼胚胎,运用全胚原位杂交技术检测eda及edar基因在斑马鱼咽齿发育部位的表达分布。比较原位杂交结果eda及edar表达区域与斑马鱼咽齿特异性标记基因dlx2b所指示咽齿部位的关系。结果 获得了dlx2b、eda及edar基因的反义mRNA探针。原位杂交结果显示,48~72 hpf时eda及edar在鳃弓牙齿相应部位可见强棕褐色阳性信号,与dlx2b所指示咽齿部位吻合。结论 Eda信号通路配体与受体在斑马鱼咽齿早期发育过程中即牙齿发生至形态发生阶段于咽齿部位特异性强表达,这一结果显示该信号通路可能参与斑马鱼咽齿早期发育的调控。     

全反式维甲酸对巨噬细胞中白介素-1β表达的调控及机制研究

  目的  探究全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）对巨噬细胞中白介素（interleukin, IL）-1β表达的调控及作用机制。  方法  巨噬细胞经1 μmol/L ATRA处理24 h后转录组测序,筛选差异表达基因,进行KEGG通路分析、GO功能分析和PPI网络分析。不同剂量ATRA处理巨噬细胞24 h后,qRT-PCR和Western blot验证炎症因子IL-1β的表达水平。Western blot和免疫荧光染色检测核因子（neuclear factor, NF）-κB信号和半胱天冬酶-1（caspase-1）的变化。  结果  测序结果显示,与空白对照组相比,巨噬细胞经ATRA处理后71个差异表达基因上调,KEGG分析显示上调基因参与IL-17信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）信号通路等,GO分析显示上调基因参与IL-1β的产生、对脂多糖的反应等生物学过程,PPI分析揭示炎症因子,黏附分子和趋化因子为ATRA作用的核心基因。体外实验表明,ATRA呈浓度依赖性促进巨噬细胞中IL-1β的表达,ATRA组中磷酸化（p）-NF-κB、NF-κB和caspase-1的表达较对照组升高（P<0.05）,且p-NF-κB发生了核转移。  结论  ATRA可能通过激活巨噬细胞中的NF-κB信号和caspase-1促进炎症因子IL-1β的表达。     

真核表达质粒pVAX1的应用

从20世纪90年代DNA疫苗诞生以来,其在医学领域已取得长足的进步和发展,它的出现为预防感染性疾病的发生提供了一种新思维、新方法。但是,目前在DNA疫苗中所应用的载体质粒仅局限于实验室研究和动物实验,如何使DNA疫苗应用于人体实验,最终走向临床研究,是摆在当今广大科研人员面前的关键难题。pVAX1的出现为解决这一难题提供了可能,它是由美国食品和药品管理委员会（FDA）推荐的唯一可以应用于人体实验的载体质粒。     

变形链球菌重组质粒pcDNA3-pacA/pcDNA3-pacP免疫定菌鼠的龋齿记分研究

目的　观察已构建的基因重组质粒 pc DNA3- pac A和 pc DNA3- pac P作为防龋疫苗的防龋效果。方法　分别将基因重组质粒 pc DNA3- pac A、pc DNA 3- pac P和 pc DNA3- pac A+pc DNA3- pac P联合使用作为基因疫苗注入免疫定菌鼠颌下腺区皮下 ,以 Keyes龋齿计分法评估免疫后定菌鼠磨牙的患龋情况。结果　重组质粒单独免疫组和联合免疫组大鼠的龋齿计分均明显低于阴性对照组和空白对照组 (P<0 .0 5 ) ;联合免疫组和 pc DNA3-pac A组的龋齿记分均明显低于 pc DNA3- pac P组 (P<0 .0 5 )。结论　重组基因质粒 pc DNA3- pac A和 pc DNA3- pac P均可有效的控制龋损的发生 ,降低龋坏程度 ,有望成为防龋基因疫苗。     

变形链球菌表面蛋白可变区与葡聚糖合成的关系

目的:探讨变形链球菌表面蛋白可变区与葡聚糖合成的关系。方法:取本课题组前期工作所获得的变链c型临床株,分成水溶性葡聚糖(W SG)组和水不溶性葡聚糖(W IG)组;每组又按葡聚糖合成能力分为合成量高(ABS>0.3)与合成量低(ABS<0.15)组。以所选细菌DNA为模板,PCR扩增表面蛋白V区编码基因SrV ,经DdeI酶切分型,比较各基因型在两组细菌中的分布情况。结果:1)两组均有4种基因型(A、B、C、D)并且在构成比上都以A、B型占多数,C、D型所占比例较少且存在明显差异;2)在W SG组主要基因型的分布出现差异:合成量高的以A型为主占50%,B型占33.33%,C型占11.11%;合成量低的以B型为主占50%,A型占30.77%,C型19.15%。3)在W IG组A、B型的分配基本相似,均在40~48%之间。结论:变形链球菌表面蛋白可变区的基因型分布与水溶性葡聚糖的合成存在一定的相关性而与水不溶性葡聚糖的合成未见明显关联。     

fth1b基因敲除对斑马鱼咽齿早期矿化的影响研究

目的 探索铁蛋白重肽基因(fth1b)在斑马鱼咽齿发育过程中的表达模式及其功能,为后续牙齿相关研究奠定基础.方法 收集受精后56、72、96及120 h斑马鱼胚胎,运用整胚原位杂交技术检测fth1b基因在斑马鱼咽齿发育过程中的表达;并运用规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术对fth1b基因特...     

三维培养牙髓间充质细胞外泌体微小RNA表达谱分析

目的分析并比较二维(2D)与三维(3D)培养条件下人牙髓间充质细胞(DPSCs)外泌体(Exo)微小RNA (miRNA)的表达谱。方法2D与3D条件下分别培养DPSCs,提取细胞Exo,采用透射电子显微镜、蛋白质免疫印迹及纳米颗粒追踪分析等方法观察并鉴定;通过高通量测序筛选差异表达miRNA,采用Dr.Tom系统及TargetScan网站进行生物信息学分析及组织再生修复相关靶基因预测。结果 3D培养下收集的DPSC-Exo均呈现"茶托样"双层膜结构,CD63和CD9表达阳性,粒径分布符合外泌体特征,与2D培养的DPSC-Exo一致。高通量测序共计检测外泌体来源miRNA 253个,其中3D组表达222个,特有表达99个;与2D组相比,表达显著差异60个[︱log₂(3D/2D)︱≥1,Qvalue≤0.001]。差异miRNA主要参与的生物学过程与分子功能分别为细胞过程和结合;京都基因与基因组数据库(KEGG)通路富集分析显示在代谢通路有显著富集。miR-302的候选靶基因有成纤维细胞生长因子(FGF) 19和表皮生长因子受体等;miR-24-3p可能靶向神经元...     

骨髓间充质干细胞Fas／FasL介导的免疫调节在结肠炎治疗中的作用北大核心CSCD

目的探索卵巢摘除术(OVX)所致骨质疏松症小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)与假手术组(sham)BMSC治疗结肠炎效果差异,明确Fas/FasL表达水平改变情况及其下游T淋巴细胞趋化及凋亡程度的差异。方法建立实验性结肠炎模型,OVX小鼠骨质疏松及假手术模型,对比注射OVX组与sham组小鼠BMSC治疗结肠炎的效果,检测2组BMSC对T淋巴细胞趋化及凋亡的差异,采用RT-PCR和Western blot法对BMSC的凋亡相关基因Fas/FasL的表达进行对比。结果注射雌激素缺乏所致骨质疏松小鼠的BMSC与注射假手术组的BMSC相比,表达Fas/FasL降低,从而使T淋巴细胞趋化及凋亡能力减弱,导致用OVX-BMSC治疗结肠炎效果较差。结论 OVX-BMSC通过降低自身Fas/FasL表达减弱肠炎小鼠T淋巴细胞的趋化和凋亡。     

变形链球菌重组质粒作为防龋基因疫苗安全性的研究

目的　本研究将已构建的重组质粒pcDNA3-pacA和pcDNA3-pacP经颌下腺区注射免疫wistar大鼠 ,观察基因重组质粒对机体的影响。方法　重组质粒pcDNA3-pacA、pcDNA3-pacP和pcDNA3-pacA与pcDNA3-pacP联合使用作为基因疫苗经颌下腺区皮下注射免疫定菌鼠 ,观察并记录实验前后各实验组大鼠的体重变化。结果　重组质粒免疫组大鼠的体重变化与阴性对照组和空白对照组的差异无统计学意义 (P>0 .0 5 )。结论　重组质粒pcDNA3-pacA和pcDNA3-pacP免疫后 ,对机体发育无影响 ,具有可靠性和安全性     

视黄酸信号通路调控咽弓神经嵴影响斑马鱼牙齿发育的研究

目的研究视黄酸（RA）信号通路在斑马鱼颅神经嵴迁移至咽弓神经嵴对牙齿发育的影响。方法将野生型斑马鱼胚胎与转基因斑马鱼胚胎各分为3组,分别采用1×10^-7~6×10^-7 mol·L^-1梯度浓度的RA（RA处理组）、1×10^-7 mol·L^-1的4-二乙氨基苯甲醛（DEAB）（DEAB处理组）、与RA处理组相应浓度的二甲基亚砜（DMSO对照组）处理24 hpf胚胎9 h。制备dlx2a、barx1、dlx2b基因的反义探针,运用整胚原位杂交技术检测野生型斑马鱼48~72 hpf胚胎的dlx2a、dlx2b、barx1基因表达,荧光显微镜观察转基因斑马鱼4 dpf胚胎。结果获得3个基因的反义mRNA探针。与DMSO对照组相比,1×10^-7 mol·L^-1RA处理组barx1、dlx2a在咽弓神经嵴的表达明显增强,并有由咽弓神经嵴向后段咽弓牙齿萌出位点迁移的趋势,绿色荧光向周边咽弓扩散;4×10^-7 mol·L^-1 RA处理组胚胎致畸率和死亡率极高,3×10^-7 mol·L^-1 RA处理组1/3胚胎发育迟缓。DEAB处理组神经嵴发育不良,barx1、dlx2a表达降低,dlx2b在牙齿位点的表达有所延迟。结论 RA能够通过调控咽弓神经嵴发育过程,进而调控牙齿发育前体细胞,最终达到调控牙齿发育的过程。