ctB和ure I双基因融合表达及其免疫特性分析

目的构建霍乱毒素B亚单位(CtB)和幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白(UreI)融合的原核表达质粒pET32a( )ctB/ureI,并初步研究融合蛋白CtB/UreI的表达特性和免疫特性。方法PCR从pUC18ctB中克隆ctB基因,定向在pET32a( )/ureI的ureI基因5′端插入ctB基因,构建ctB和ureI双基因原核表达质粒pET32a( )ctB/ureI,转该质粒于E.coliBL-21(DE3),经酶切和序列分析鉴定工程菌。IPTG诱导表达,HP-His亲和层析纯化,SDS-PAGE和Gel-ProAnalizer4分析,重组蛋白免疫BALB/c小鼠。用Westernblot和ELISA分析重组蛋白的免疫特性。结果工程菌含完整的ctB和ureI基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%。在22℃,1mmol/LIPTG诱导4h后,重组蛋白的表达占菌体总蛋白12%,亲和层析纯化后蛋白纯度为94.3%。Westernblot表明重组蛋白分别能与相应的抗体反应,该蛋白免疫小鼠后能产生相应的IgG抗体。结论成功构建了能表达CtB/UreI蛋白的大肠杆菌表达菌株。对融合蛋白表达和纯化后,初步证明了该重组蛋白有CtB和UreI的双特异反应原性和免疫原性,为研究新型幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。     

抗HEL抗独特型抗体制备及酶功能模拟初探

用针对鸡卵清溶菌酶（ＨＥＬ）不同表位的鼠单克隆抗体（ＭＡｂ１）免疫同系小鼠，取免疫鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，经过筛选，克隆化，获得了多株分泌单克隆抗独特型（ＭＡｂ２）抗体的杂交瘤细胞株，其中用抗ＨＥＬ酶活性中心的ＭＡｂ１诱导产生的ＭＡｂ２中有两株可以模拟ＨＥＬ的溶菌活性。其溶菌活性在单独作用时较弱，混合作用时增强，但均明显弱于ＨＥＬ本身。结果表明：在以酶分子作抗原的免疫网络中的确存在     

冰黄肤乐软膏抗皮肤癣菌活性及止痒作用研究

目的：研究冰黄肤乐软膏抗皮肤癣菌活性及止痒作用。方法：使用体外抑菌法及豚鼠止痒模型。结果：冰黄肤乐软膏对皮肤癣菌三个属（毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢子菌属）的代表株及临床株均有较强的抑菌和杀菌作用,并且对磷酸组胺豚鼠痒阈值具显著提高作用。结论：冰黄肤乐软膏为一具有较好的抗癣止痒作用的天然药物复方制剂。     

IL-18-PE38重组免疫毒素的原核表达及其鉴定

目的构建绿脓杆菌外毒素PE38融合鼠IL-18基因的原核表达载体并鉴定其表达。方法首先采用RT-PCR获得小鼠IL-18基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建小鼠IL-18与PE38融合基因的原核表达载体PRKL-IL-18PE38,重组载体经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实连接片段的正确性后,再转染感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定其相对分子质量及特异性。结果酶切分析、PCR鉴定和DNA测序等证实,IL-18-PE38免疫毒素的原核表达载体被成功构建,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达产物的相对分子质量与预期值一致,且所表达蛋白可被抗IL-1818的特异性抗体所识别。结论IL-18-PE38融合基因原核表达载体的获得,为进一步研究其对Th1细胞的靶向细胞毒性及临床应用奠定了基础。     

小鼠β防御素1与甲型流感病毒M2e融合基因表达及其免疫特性研究

目的构建mBD1与M2e融合基因的真核表达载体,并检测其在MDCK细胞中的表达情况,初步探讨其免疫特性。方法利用PCR方法分别扩增mBD1与M2e基因片段,再通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)将mBD1与M2e通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD1-M2e。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)获得重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD1-M2e,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光、RT-PCR产物序列分析检测融合蛋白表达情况,最后采用MTT法检测mBD1-M2e融合蛋白刺激淋巴细胞增殖能力。结果经鉴定后证实构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD1-M2e正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,该细胞培养上清液能刺激淋巴细胞增殖。结论本研究成功构建mBD1-M2e融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,这一结果为进一步研究新型高效通用的流感病毒核酸疫苗奠定了坚实的基础。     

围术期TOF监测与残余肌松潘库溴铵与维库溴铵的比较

目的研究潘库溴铵与维库溴铵术后残余肌松发生率,探讨围术期应用TOF监测降低术后残余肌松发生率的可行性.方法81例ASAⅠ～Ⅱ级成年择期手术病人,随机分为维库溴铵监测(V+M)组;维库溴铵未监测(V)组;潘库溴铵监测(P+M)组及潘库溴铵未监测(P)组4组.麻醉方法为静脉注射2.0～2.5mg/kg异丙酚,潘库溴铵或维库溴铵0.08～0.12mg/kg,3min后气管插管,麻醉维持应用50%N2O、异氟醚,间断给予芬太尼.使用TOF-GUARD监测仪监测肌松.P+M组和V+M组在TOF计数出现1～2个颤搐反应时给新斯的明0.04mg@kg-1、阿托品0.02mg@kg-1.拮抗;P组和V组根据临床反应判断是否给予拮抗及剂量.观察各组病人到ICU后残余肌松发生率(T4/T1＜0.70)及持续时间.结果4组病人到ICU后残余肌松发生率分别为V+M组23.80%、V组39.13%、P+M组42.11%、P组83.33%,P组残余肌松发生率显著高于V组(P＜0.01),而且监测组残余肌松发生率显著低于未监测组(P＜0.05).4组残余肌松持续时间分别为V+M组(11.11±5.48)min、V组(30.00±15.12)min、P+M组(21.15±11.62)min、P组(44.87±31.39)min,未监测组明显长于监测组(P＜0.05).未监测组潘库溴铵及维库溴铵总的用药量分别大于监测组(P＜0.05).结论1.围术期TOF监测可明显降低残余肌松发生率;2.潘库溴铵残余肌松发生率及持续时间均显著高于维库溴铵,在无神经肌肉功能监测的情况下,应用潘库溴铵应严加注意;3.应用非去极化肌松药阻滞后进行术后肌松拮抗是必要的.     

一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes真核表达质粒的构建及功能

目的 构建一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes的真核表达质粒,并对这种免疫毒素的功能进行初步研究。方法 通过RT-PCR的方法,从小鼠肝脏中获得Rantes基因;将Rantes基因插入到含有DT390片段的真核质粒SRα中,构建成重组质粒;重组质粒转入大肠杆菌JM109,筛选出含有正确插入片段的克隆;限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒,并进行DNA序列分析;用脂质体介导法转染NIH3T3细胞,免疫荧光检测重组质粒的表达情况;MTT法测定DT390-Rantes的表达活性。结果 经过酶切分析及DNA测序证实,Rantes基因正确插入到真核表达质粒SRα中,并在NIH3T3细胞中表达;MTT法证实,重组免疫毒素DT390-Rantes能在体外杀伤活化的T细胞。结论 成功地构建了一种新型重组免疫毒素真核表达质粒DT390-Rantes-SRα,该质粒可在真核细胞中瞬时表达,其转染上清对活化的T细胞具有杀伤作用。     

小鼠IL-18真核表达质粒的构建及其生物学活性的鉴定

目的构建小鼠白细胞介素18(interleukin18,IL-18)的真核表达质粒,并检测其表达的IL-18的生物学活性。方法采用RT-PCR获得小鼠IL-18基因,通过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及连接反应,构建pEGFP-mIL-18真核表达载体,重组载体经过限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实连接片段的正确性后,转染HEK293细胞系,荧光显微镜观察GFP-mIL-18融合蛋白的表达,收集转染后72h的上清液,MTT法检测上清液中IL-18表达产物的生物学活性。结果酶切分析、PCR鉴定、DNA测序表明成功地构建了pEGFP-mIL-18真核表达载体,MTT法证明表达产物有刺激小鼠脾细胞增殖的功能。结论所获pEGFP-mIL-18真核表达载体能在体外表达具有生物学活性的IL-18,为进一步研究IL-18的功能和运用奠定了基础。     

西多福韦对HeLa细胞增殖抑制作用的研究

目的 研究抗病毒药西多福韦(CDV)对HeLa细胞的增殖抑制作用.方法 采用MTT法分析CDV和阳性对照药顺铂(DDP)对HeLa细胞增殖活力的影响;利用细胞集落形成实验和Giemsa染色技术,观察CDV和DDP导致HeLa细胞凋亡情况;利用流式细胞仪观察CDV和DDP对细胞凋亡及细胞周期影响.结果 MTT法和细胞集落实验结果显示CDV能明显抑制HeLa细胞的增殖活性;流式细胞仪测定显示CDV和DDP使HeLa细胞阻滞于细胞周期的S期,并诱导HeLa细胞发生凋亡.结论 CDV对HeLa细胞具有明显的增殖抑制作用,并能诱导细胞凋亡,CDV有可能成为宫颈癌治疗的另一策略.     

流感病毒抗肿瘤作用的初步研究

目的：探索流感病毒的抗肿瘤作用。方法：通过用小白鼠肉瘤细胞（Ｓ１８０）接种昆明系小鼠而形成荷瘤小鼠，再注射流感病毒于荷瘤小鼠，观察其抑制肉瘤细胞生长情况。结果：活流感病毒注射后的抑瘤率达到５８．２０％，而ＰＨＡ和５－氟脲嘧啶（５－ＦＵ）的抑瘤率分别为６５．９２％和５９．０６％，三者之间无显著性差异（Ｐ〉０．５）。结论：活流感病毒在试验动物体内具有抑制Ｓ１８０瘤细胞生长的作用。