从脂肪抽出物的脂类和液体部分提取脂肪来源干细胞的细胞生物学研究

目的 探索从抽吸物中脂质和液体部分分离、体外培养脂肪组织来源干细胞的新方法,并通过其生长动力学、形态学、分化能力、细胞衰老和表面标记物轮廓5个方面的特征进行鉴定比较.方法 抽脂术后抽吸物分解为脂质和液体部分.脂质和液体部分分别用酶消化法和直接离心过滤法分离、培养ASCs,观察其在体外培养的形态学和生物学特点;MTT比色法测细胞活性,统计学分析;流式细胞仪测定细胞周期;随机选取3、4、6、8代做丫啶橙染色检测细胞的衰老;用流式细胞仪、免疫组织化学染色法鉴定其表面分子表达;成脂、成骨定向诱导分化,油红O染色、茜素红染色定性.结果 从吸脂抽吸物的脂质和液体两部分中都能培养出大量的ASCs,分别为PLA和LAF,呈成纤维细胞样贴壁生长,MTY测定细胞活性及细胞周期研究发现PLA、LAF这两种细胞的活力与增殖能力是非常相似的;丫啶橙染色3、4、6、8代细胞无明显衰老;流式细胞仪检测显示干细胞标志的CD29、CIM4、CD34的表达均呈阳性;免疫化学染色发现Ⅷ因子、CD31、CD105、SMA表达阳性;成脂诱导分化2周后,细胞内可见有大量脂滴,油红O染色可见胞浆内有大量红染颗粒.成骨诱导2周后,细胞可见白色矿化钙盐沉积,茜素红染色可见成骨细胞红染.结论 本实验建立了一种自人体脂肪抽吸物中脂质和液体部分分离和培养ASCs的新方法,经济简便实用,从成人脂肪抽吸物液体部分中也可以分离得到大量的可为脂肪组织工程所利用的ASCs,其细胞量与脂质来源的ASCs的量基本相同.贴壁的LAF与PLA细胞在细胞的生长动力学、形态学、细胞衰老、表面标志物和分化能力等方面具有非常相似的特性,都具有很强的增殖活性且衰老率较低,能稳定表达干细胞表面标志并能实现定向成脂、成骨多向诱导分化.这种经过最小限度人工干预的ASCs可能是将来脂肪组织工程比较理想的种子细胞之一.     

丙泊酚复合利多卡因对开颅手术应激反应的影响

目的 观察开颅手术全麻后苏醒拔管期小剂量丙泊酚复合利多卡因对应激反应的影响。方法 选择开颅手术患者30例,ASAⅠ～Ⅱ级,随机分成丙泊酚复合利多卡因组（A组）和生理盐水组（B组）,两组患者均接受芬太尼、丙泊酚、维库溴铵和吸入1.0%～1.5%异氟醚的全身麻醉,术毕A组患者静脉注射0.5mg/kg丙泊酚＋1mg/kg利多卡因,B组患者静注等容量生理盐水作对照,观察两组患者拔管前后收缩压、舒张压、心率的变化。结果 A组患者在拔管时血压、心率无明显的变化,B组患者在拔管时血压、心率明显的升高（P〈0.05）。结论 小剂量丙泊酚复合利多卡因可抑制开颅手术全麻后苏醒拔管期应激反应,平稳苏醒。     

人脂肪来源干细胞复合I型胶原支架构建工程化脂肪组织的实验研究

目的 探讨构建组织工程化脂肪组织的可行性,为临床修复软组织缺损寻找一种新方法.方法 以酶消化法从人脂肪抽吸术抽吸物脂质部分获取人脂肪来源干细胞作为种子细胞,并行Dil体外荧光标记,以Ⅰ型胶原支架为载体材料,将细胞成脂诱导后,以1×107/ml细胞密度与支架复合后接种于裸鼠左侧背部皮下,未诱导组不对细胞进行任何诱导,以相同方式接种于裸鼠右侧背部皮下,空白对照组将Ⅰ型胶原空白支架接种于裸鼠颈部正中皮下,每组各6只实验鼠;于第12周取材,通过大体和荧光显微镜观察、湿重测定、组织学检测和油红0染色定性判断体内成脂能力.结果 原代培养的脂肪来源干细胞,经成脂诱导能演变为成熟脂肪细胞,油红0染色阳性.诱导组裸鼠皮下均发现新生组织块,新生物平均湿重为0.020 g,常规病理切片及油红0染色均证实其为成熟脂肪组织,Dil荧光显色阳性证实其为外源性;未诱导组4只裸鼠皮下发现新生组织块,新生物平均湿重为0.014 g,常规病理切片及油红0染色证实其含有部分成熟脂肪组织,Dil荧光显色阳性证实其为外源性.两组新生物湿重比较差异有统计学意义(P<0.01);空白对照组未见新生组织形成.结论 用酶消化法从人脂肪抽吸术抽吸物脂质部分提取的细胞为脂肪组织来源干细胞,该细胞能作为种子细胞经成脂诱导后.与Ⅰ型胶原支架在体内成功构建脂肪组织.     

脂肪组织来源干细胞的细胞生物学研究

目的 探索从脂肪抽吸物中脂质部分分离、培养脂肪组织来源干细胞(ASCs)的方法,并通过其生长动力学、形态学、分化能力、细胞衰老和表面标记物轮廓5个方面的特征进行鉴定.方法 酶消化法处理脂类抽吸物,分离培养ASCs,观察细胞形态;MTT比色法测细胞活性并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期,丫啶橙染色检测细胞的衰老;流式细胞仪、免疫组织化学染色法鉴定其表面分子表达;成脂定向诱导分化后油红"O"染色定性.结果 原代培养的ASCs呈成纤维细胞样贴壁生长,具有很强的增殖能力;MTT比色法活性测定均证实ASCs具有很强的增殖活性,细胞周期研究发现ASCs具有干细胞的特性.丫啶橙染色3、4、6、8代无明显衰老.流式细胞仪检测显示干细胞标志的CD29、CD44、CD34的表达均成阳性;HLA-DR、CD133表达为阴性;免疫化学染色发现Ⅷ因子、CD31、CD34、CD105、SMA表达阳性;成脂诱导分化2周后,细胞内可见有大量脂滴,油红"0"染色可见胞浆内有大量红染颗粒.结论 自人体脂类抽吸物中通过酶消化法能分离和培养出具有干细胞特性的成纤维细胞样细胞群,该细胞具有很强的增殖活性且不易衰老,能稳定表达干细胞表面标志并能实现定向成脂分化.     

腺病毒重组绿色荧光蛋白转染脂肪组织来源干细胞的特点

目的:体外基因转染成人脂肪组织来源的干细胞后,观察腺病毒载体能否有效地转染及对细胞的影响。实验应用腺病毒增强型绿色荧光蛋白进行体外基因转染以验证基因修饰效果。方法:实验于2006-10/2007-02在南方医科大学生物技术工程研究所实验室完成。实验对象:脂肪组织取自南方医科大学附属医院整形科手术室5例成年女性腹部吸脂术患者,排除了冠心病、高血压及糖尿病等。手术前均与患者本人谈话并征得其同意,获取脂肪组织进行实验,并经医院伦理委员会批准。实验方法:分离人脂肪组织,进行原代和传代培养。取第4代脂肪组织来源干细胞进行流式细胞术表型鉴定,并将0,10,20,30,50,100感染复数值的腺病毒重组增强型绿色荧光蛋白,通过活力和增殖实验进行体外转染,观察其对脂肪组织来源干细胞的影响。结果:5份标本均成功培养出脂肪组织来源干细胞,生长良好,均成功进行了腺病毒重组增强型绿色荧光蛋白基因转染。①原代细胞培养48h后可见细胞贴壁,13d后可见细胞铺满瓶底80%细胞绝大多数呈梭形。1∶2传代后细胞增殖速度明显加快,3d后细胞即已长满培养瓶底,即可传代。第4代的脂肪组织来源干细胞表型,呈CD29 ,CD34-,CD44 ,CD106-,CD133-和HLA-DR-。②腺病毒重组增强型绿色荧光蛋白转染24h可见绿色荧光,5d荧光表达强度最强,脂肪组织来源干细胞细胞传代培养后仍有强荧光表达。③转染组和未转染组细胞培养1,3,5,7,9,11d时细胞活力、增殖分化均无统计学差异。结论:腺病毒重组增强型绿色荧光蛋白可成功进入脂肪组织来源干细胞,感染复数值为50时较为理想。     

荧光活性染料Dil标记人脂肪干细胞

目的观察荧光活性染料Dil标记的人脂肪干细胞生长增殖情况,为脂肪干细胞研究寻找理想的细胞标记方法.方法实验于2006-06/09在广州市创伤外科研究所完成.取人吸脂术中吸出的脂质部分,知情同意并签署知情同意书,用PBS缓冲液反复冲洗,剪刀剪碎.0.1%胶原酶37℃消化40min,使用等量体积含体积分数为0.1胎牛血清+DMEM+双抗完全培养基中和后,1 300 r/min离心5 min,去上清液,沉淀混悬后150 UM尼龙网过滤,按1×104-2×104接种于25 cm2培养瓶中,置入37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养,2～3 d换液.待细胞生长融合达80%即可传代,取第3～4代细胞供实验用.将收集细胞用PBS清洗离心2次,加入无血清DMEM制成细胞悬液,以1×109 L-1密度加入5μL Dil应用液,37 ℃下孵育20 min,1 500 r/min离心5 min,PBS清洗离心2次,加入含体积分数为0.1胎牛血清DMEM培养基,应用荧光显微镜观察24,48,72 h脂肪干细胞显色情况及形态变化.检测脂肪干细胞上清液乳酸脱氢酶含量及细胞XTT比色值,分析脂肪干细胞受损及增殖情况.结果①Dil标记脂肪干细胞体外观察台盼蓝染色见脂肪干细胞活力好,仅偶见蓝染细胞,荧光显微镜下观察,见全部细胞标记后均显红色荧光,标记的脂肪干细胞呈梭形,胞浆丰富,保持了良好的正常形态,Dil标记阳性率为100%.Dil标记后早期细胞形态呈荧光环状,48 h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光.②培养脂肪干细胞上清液中乳酸脱氢酶含量及XTT法检测脂肪干细胞受损及增殖情况未标记Dil的脂肪干细胞与标记Dil的脂肪干细胞形态、细胞上清液乳酸脱氢酶含量及XTT值差异不明显(P＞0.05).结论①Dil能有效标记体外脂肪干细胞,并在细胞内稳定表达.②Dil标记的脂肪干细胞形态良好,对活体细胞无毒性.     

全麻复合硬膜外麻醉用于后腹腔镜肾脏手术的临床观察

目的观察全麻复合硬膜外麻醉用于后腹腔镜肾脏手术的临床效果。方法选择拟在后腹腔镜下行肾脏手术的患者40例,ASAI～IⅡ级,随机分为两组,单纯全麻组（GA组）和全麻复合硬膜外组（GEA组）,每组20例。GA组患者给予常规全麻诱导,气管内插管,术中以丙泊酚、瑞芬太尼及顺式阿曲库铵持续静脉泵注维持麻醉,术后行PCA。GEA组患者先行硬膜外麻醉,待硬膜外阻滞平面确定后,再行全麻诱导（同GA组）,气管内插管,术中以丙泊酚持续静脉泵注及间断硬膜外追加罗哌卡因维持麻醉,并根据手术需要间断静注小剂量顺式阿曲库铵,术后行PCEA。观察并记录两组患者术中心率、血压、拔管时间、全麻药用量及血管活性药的使用情况。观察两组患者术后镇痛情况,并行VAS评分及术后并发症如恶心、呕吐、皮肤瘙痒和烦躁的发生率。结果T。时两组患者心率、收缩压及舒张压差异比较无统计学意义（P〉O．05）,GA组T1,T2及T3时均较T0时显著升高（P〈0．05）,亦明显高于GEA组同时间点指标值（P〈0．05）。GEA组全麻药物用量明显少于GA组（P〈O．05）。GEA组患者拔管时间明显短于GA组（P〈0．05）。阿托品、麻黄碱的用药情况差异无意义（尸〉0．05）。术后镇痛效果比较：术后镇痛12h、24hVAS评分GEA组低于GA组（P〈O．05）。术后12h、24h烦躁的发生率GEA组低于GA组（P〈0．05）。两组术后恶心、呕吐及皮肤瘙痒的发生率差异无意义（P〉O．05）。结论全麻复合硬膜外麻醉用于后腹腔镜肾脏手术,可减轻患者术中血流动力学波动,减少术中全麻药用量,缩短拔管时间,且术后镇痛更加完善,同时降低术后烦躁的发生率。     

VEGF165贷基因转染脂肪组织来源干细胞后目的基因表达

目的检测人脂肪组织来源干细胞（ADSC）经血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因转染后目的基因的表达，为下一步利用经基因转染的ADSC构建血管化组织工程脂肪组织打下基础。方法行腺病毒重组血管内皮生长因子165（Ad-VEGF165）基因转染ADSC，通过免疫细胞荧光和ELISA鉴定VEGF在细胞中的表达情况。结果经免疫荧光和ELISA检测证实腺病毒能成功地将VEGF165基因转染至ADSC中，并获得有效的表达。结论采用Ad-VEGF165基因转移技术，可以将VEGF转染至ADSC中，并有目的基因的表达，为促进脂肪组织工程血管化奠定基础。     

人脂肪组织来源基质干细胞成脂分化及Ad-EGFP体外转染研究

目的探讨重组腺相关病毒载体能否有效地转染脂肪组织来源基质干细胞及（ADSC）其影响，同时为组织工程寻找一种理想的病毒载体及细胞示踪标记方法。方法采用抽脂法分离培养ADSC，诱导培养液诱导细胞成脂分化，行细胞形态学检查，细胞表面抗原鉴定，油红。染色，评价细胞成脂情况。在此基础上转染Ad-EGFP，观察细胞形态学改变及荧光表达的时间与强度，计算转染效率，确定转染的理想感染复数（MOI）值，同时通过活力和增殖实验进行Ad-EGFP体外转染对ADSC的影响研究。结果细胞扩增迅速，形态良好，经诱导后呈现明显的成脂改变。实验确定Ad转染细胞的较佳MOI值为50，以此值转染Ad-EGFP后细胞荧光持续高效稳定表达，并可传至子代，可以满足示踪标记的需要。Ad转染效率高，对细胞活性影响小。结论ADSC的培养和分化能满足脂肪组织工程的要求；Ad长期稳定表达目的基因，是一种理想的组织工程病毒载体；基因转染方法高效稳定表达EGFP。可作为种子细胞良好的示踪标记方法。     

瑞芬太尼联合臂丛神经阻滞用于上肢手术的临床观察

目的观察瑞芬太尼持续静脉泵注联合臂丛神经阻滞用于上肢手术的麻醉效果。方法随机将70例拟行单侧上肢手术的患者分为两组,两组患者均行臂丛神经阻滞。A组为芬太尼组,B组为瑞芬太尼组,每组各35例。B组持续静脉泵注瑞芬太尼0.05μg/（kg.min）,直至手术结束。术中当患者VAS评分〉3或出现体动反应时,A组追加芬太尼0.05mg静脉滴注;B组增加瑞芬太尼泵入剂量0.01μg/（kg.min）观察并记录患者围麻醉期血流动力学和呼吸参数（HR.MAP.RR.SPO2）变化,麻醉镇痛效果及术中体动反应发生率。结果两组患者围麻醉期血流动力学和呼吸参数（HR.MAP.RR.SPO2）变化无显著差异（P〉0.05）;两组患者镇痛效果差异无统计学意义（P〉0.05）;瑞芬太尼组（B组）术中体动反应发生率显著低于芬太尼组（A组）（P〈0.05）。结论瑞芬太尼持续静脉泵注联合臂丛神经阻滞用于上肢手术,对呼吸、循环影响轻微,麻醉效果良好,可供临床选择应用。