组织工程技术应用面临的问题

1　组织工程技术的产生背景工程化人体组织是科学发展的必然 ,在修复人体组织缺失的工作中 ,早期应用自体组织、异体组织及合成材料 (如从人工心脏和瓣膜到髋关节假体和乳腺植入物 )。随细胞生物学、分子生物学、信息学、计算机科学的进展 ,已能对细胞在体外进行定向诱导分化为具有特定功能的特定细胞 ,生物支架材料的制备由强调细胞生长所需微环境向仿真整体结构过度 ,CAD/CAM将成为材料制备业的趋势。2　组织工程技术研究现状组织工程技术是一个多学科 /交叉学科领域 ,在这个交叉领域内应用生物学和工程学的原理研发组织替代物 ,达到重…     

镍钛合金钛与钛铌涂层防止Ni2+析出的体内实验研究

[目的]探讨镍钛合金（NiTi）表面金属钛（Ti）、钛铌合金（TiNb）涂层后对Ni2＋析出的影响.[方法]成年犬18只,随机分为4组,NiTi组、Ti涂层组、TiNb涂层组各5只,空白组3只,分别于骶棘肌内和股骨内植入立方体试件和圆柱型试件各10枚,12个月后处死取材,用石墨炉原子吸收仪分别检测心、肝、脾,肺、肾、脑、骨、鼻咽粘膜、血液、肌肉、试件周围的骨组织和肌肉组织的Nit2＋含量.[结果]非修饰的NiTi组试件周围的骨组织和肌肉组织的Ni2＋含量与同组同种组织、异组同种组织的Ni2＋含量有显著差异（P〈0.05）.[结论]本试验初步证明,NiTi表面金属钛、钛铌合金涂层起到了防止Ni2＋析出的作用.     

海绵状、泥灰状脱钙骨基质修复骨缺损

目的探讨海绵状脱钙骨基质(DBM)和泥灰状DBM修复骨缺损的能力。方法将兔四肢长骨骨干脱脂、脱钙后制成长度为500～1000 μm的纤维状及直径为200～400μm的颗粒状DBM,并与2%明胶混合分别制成海绵状DBM和泥灰状DBM。在9只兔双侧桡骨中段做一长10mm的骨膜骨缺损,分别植入海绵状DBM和泥灰状DBM及空白对照,每组各6个缺损,术后观察6周,于4、6周时拍摄X线片,并对实验动物的大体标本、骨密度、生物力学、新生骨矿化率及病理组织学改变进行观察。结果术后4、6周X线片显示两实验组骨缺损均修复,骨髓腔完整;空白对照组无一例修复骨缺损。骨密度测量显示海绵状DBM组新生骨骨密度与正常桡骨间差异无显著性(P >0.05),但泥灰状DBM组的新生骨骨密度与正常桡骨间差异有显著性(P< 0.05)。术后6周生物力学测定显示海绵状DBM组新生骨极限压缩强度值与正常桡骨差异无显著性(P >0.05),泥灰状DBM组低于正常桡骨且差异有显著性(P< 0.05)。两实验组新生骨矿化率差异无显著性(P >0.05)。组织学观察显示两实验组中DBM绝大部分被吸收,形成板状骨骨小梁及完整的骨髓腔,塑形完整, 新生骨内可见骨单位及局部尚未完全骨化的新生骨。结论海绵状DBM和泥灰状DBM均具有诱导成骨活性和骨传导能力,使用方便,新生骨塑形完整,生物力学强度高,矿化     

关节软骨源性微载体与软骨细胞的体外相容性

目的评估人关节软骨源性微载体与人软骨细胞的体外粘附性。方法切取人关节软骨,对之冷冻干燥后,经粉碎机粉碎,筛取150～200μm大小的软骨粒,经0.25%的胰酶在37℃消化24h,再经1%的化学去污剂TritonX-100震荡72h,蒸馏水清洗48h后,在冻干机内再次冻干12h,经钴60灭菌后,与第6代人软骨细胞共同培养,分别在倒置显微镜下和电镜下观察即刻、2h、8h、30h的粘附情况。结果倒置显微镜下见软骨粒变为绒球状或毛刷状,将此微载体加入培养基后,即见有呈圆球形的软骨细胞与微载体相粘附,2h见微载体上粘附了大量软骨细胞,仍呈圆球形,8h见微载体上粘附的大量软骨细胞仍呈圆球形,而瓶底贴附的软骨细胞已呈现为成纤维细胞样形状,30h见软骨细胞-微载体复合体已沉降贴附于培养瓶底部,软骨细胞增殖明显并向周围伸展,而电镜下观察见粘附于微载体上的软骨细胞仍维持了软骨细胞的形状。整个观察期间均见软骨细胞增殖良好,提示制备的关节软骨源性微载体对软骨细胞无毒害作用。结论关节软骨源性微载体与软骨细胞的体外相容性良好。     

人关节软骨脱细胞基质制备实验

背景:对天然的细胞外基质进行处理,剔除其抗原成分,保留了组织结构的完整性,这种材料具有良好的生物相容性,能为细胞创造尽可能接近体内的培养环境,因此应是组织工程中细胞培养支架的首选.目的:制备人关节软骨脱细胞基质,为进一步研究关节软骨基质作为细胞外支架材料提供方法学资料.设计:以骨组织标本为实验对象,单一样本研究.单位:解放军总医院骨科研究所.材料:实验于2004-01/05在解放军总医院骨科研究所完成.材料来自因股骨颈头下型骨折行关节置换而切除的股骨头.方法:切取人关节软骨,剪裁成3.5 mm&;#215;4.5 mm&;#215;2.0mm大小共10块,冻干处理12h,采取化学去污剂Triton X-100及DNA酶和RNA酶等试剂制备脱细胞的人关节软骨.用苏木精-伊红、番红O及软骨蛋白聚糖免疫组化染色等方法进行关节软骨脱细胞定性检测.主要观察指标:脱细胞关节软骨的组织学观察以及软骨蛋白聚糖免疫组织化学染色结果.结果:①苏木精-伊红染色、番红O染色均显示细胞陷窝内已无细胞结构.②软骨蛋白聚糖免疫组织化学染色阳性,提示脱细胞关节软骨基质内仍存在软骨蛋白聚糖.结论:人关节软骨冻干后,经去污剂-酶等处理方法可脱去软骨的细胞成分,成功制备人关节软骨脱细胞基质.其中保留的软骨蛋白聚糖可能仍存在原有的耐压特性.     

采用藻酸钙培养法在体外构建工程化关节软骨组织

Masuda等最近报道了用藻酸钙短期培养牛软骨细胞。然后利用收集的细胞及基质培养成无支架的软骨组织获得成功。我们试图用羊的软骨细胞，采用该方法培养无支架的软骨组织，为构建组织工程软骨用于临床开辟新的途径。     

正常人与慢性牙周炎伴有骨质疏松患者牙槽骨组织体外培养细胞系的生物学特性

背景:培养人牙槽骨细胞系,因细胞来源于牙槽骨,取材于口腔很容易污染,常导致实验室研究失败,又因为标本来自成年人,细胞分裂指数低,培养的成功率低。目的:比较无菌手术中取正常人和慢性牙周炎伴骨质疏松患者的牙槽骨组织,经体外培养,建立的传代、冻存、复苏成活的细胞系的生物学特性。比较两种细胞的生物学特性。为牙槽骨的缺损、修复、治疗提供理论和相关实验依据。设计:对照观察。单位:首都医科大学附属北京朝阳医院口腔科和解放军总医院骨科研究所。材料:无菌手术中取正常人和临床诊断为慢性牙周炎患者的牙槽骨组织。方法:由正常人和慢性牙周炎伴骨质疏松患者的牙槽骨组织经体外培养,从原代培养出来的4个细胞系(H-171、H-258、261、262)中,选出牙周炎患者组细胞系H-171,正常组H-258,用组化、免疫组化等染色,观察细胞形态。用细胞计数法计算出两种细胞倍增时间和分裂指数。经过多次传代、冻存、复苏,比较细胞的生长、老化规律。主要观察指标:两组细胞系的传代情况及生物学特性。结果:①异常牙槽骨组,原代培养一次成功,细胞形态为短梭形,3次冻存,3次复苏均存活,其倍增时间为53.4h。平均分裂指数为4‰。细胞传代20次后,仍生长良好。②正常牙槽骨组原代培养26例,因多种原因能传代的细胞系仅有3例,已传代10次,形态为长梭形,经两次冻存复苏,细胞存活、生长速度较H-171慢,倍增时间为65.9h,平均分裂指数3.5‰。③两种细胞均贴壁生长,具有成骨细胞的特点:AKP、甲苯胺兰、PAS、四环素标记矿化结节组化染色及Ⅰ型胶原、BMP-2免疫组化染色均为阳性。结论:培养出的两种细胞均具有成骨细胞特点,其中H-171生长速度较H-258快,传代20次,无明显变异,H-258传到8代开始老化,生长速度减慢。     

人关节软骨源性海绵的制备和评估☆◇

目的：制备人关节软骨源性海绵，为组织工程软骨提供合适的新型支架。 方法：把人关节软骨用生理盐水冲洗干净后，置入FD-1冷冻干燥机进行冻干处理12小时。经粉碎机粉碎，筛取38～２５um大小的软骨微粒。加入10倍体积的0.25%胰蛋白酶，在37OC消化24小时。离心后弃去胰蛋白酶，再加入10倍体积的1% Triton X-100震荡72小时。离心后弃去Triton X-100，然后用蒸馏水反复清洗48小时。离心后弃去蒸馏水，置入冷冻干燥机进行冻干处理12小时。经8-Watt 312nm的紫外线照射8小时。完成人关节软骨源性海绵的制备。对人关节软骨源性海绵进行大体和微观观察、抗离散情况并测定其孔径和孔隙率。 结果：人关节软骨源性海绵的抗离散性能良好，孔径大小在100～200um，孔隙分布均匀，孔隙率为92%。 结论：人关节软骨源性海绵具有良好的结构和孔隙率，可作为软骨组织工程支架。     

骨髓基质干细胞成骨能力的实验研究

目的:研究以骨髓基质干细胞(Bonemarrowstemcells,BMSCs)为种子细胞,海绵状脱钙骨基质(Demineralizedbonematrix,DBM)为细胞载体的组织工程块修复骨缺损的能力。方法:从兔股骨分离出的骨髓细胞经体外诱导分化条件培养,检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的表达及钙结节的形成。将培养分化的兔BMSCs经5-溴-2'-脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2'-dexyouridine,BrdU)标记后接种到兔海绵状脱钙骨基质(spongeofDBM,sDBM)支架上,细胞接种密度为每块DBM种植(4～6)×106个细胞,然后分别植入兔背部肌肉内及兔桡骨中段10mm长的骨膜骨缺损内。对照组为骨缺损内单纯植入sDBM及空白组。术后观察6周。结果:经条件培养的BMSCs体外表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及形成钙结节。体内异位植入含BMSCs的组织工程骨块可形成新骨组织,成骨方式类似软骨化骨。体内骨缺损修复实验结果显示组织工程骨块与单独sDBM均在6周完全修复骨缺损。新生骨骨密度测量组织工程骨块植入组虽然均值高于单独sDBM植入组,但差异无显著性意义(t=2.289,P=0.071)。极限压缩强度测量显示,组织工程骨块植入组新生骨生物力学强度已达正常桡骨的90%,与正常桡骨段差异无显著性意义(t=2.893,P=0.0623);单纯sDBM植入组新生骨在生物力学强度为正常桡骨的86%。新生骨矿化率结果显示     

化学去细胞法对粗大神经质量评价方法及影响因素的探讨

目的 通过对粗大神经去细胞方法的研究，探讨对去细胞神经评价和制备的适宜方法。方法 取杂种犬3只，切取5段直径6mm的新鲜坐骨神经，每段长50mm，在3％ Triton-100和7％脱氧胆酸钠溶液中去细胞处理。实验分为5组：Ⅰ组，去细胞2遍；Ⅱ组，去细胞3遍；Ⅲ组，去细胞4遍；Ⅳ组，神经段两端用4号缝合线结扎后去细胞2遍；Ⅴ组，神经段两端用4号缝合线结扎后去细胞3遍。另设对照为未经处理的新鲜犬坐骨神经。从去细胞程度、基底膜板层素（Laminin）活性、脱髓鞘程度及神经纤维管道完整性4个方面进行评价。结果 所有实验组神经段去细胞完全，Laminin活性保存完好。髓鞘染色评分以Ⅳ组和Ⅴ组最低，纤维管道完整性评分以Ⅰ组和Ⅳ组最佳。综合评价对于粗大神经的去细胞处理方法以Ⅳ组处理方法最佳。结论 化学去细胞的神经脱髓鞘程度与去细胞次数不平行。在去细胞神经的质量控制中，应考虑基底膜Laminin的活性、去细胞、脱髓鞘及结构完整性的程度。对于粗大神经的处理，结扎神经段两端后再行去细胞处理可能是一种较好的方法。