转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球对干细胞的调控

文题释义：转化生长因子β3：是转化生长因子β超家族成员,在胚胎软骨形成的多个时期都是必不可少的软骨组织形成的关键调节因子,可以促进间充质干细胞迁移并诱导其向软骨组织分化与成熟,促进软骨缺损的愈合。 聚乳酸-羟基乙酸微球：属于食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的可生物降解聚合物,具有可控的降解性和良好的生物相容性,被广泛应用于医药领域。由于其生物可降解性,聚乳酸-羟基乙酸微球微球被广泛应用于小分子药物、蛋白质和其他大分子药物的可控持续释放。 背景：转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球系统可使药物在作用部位维持有效药物浓度,提高生长因子的利用率。 目的：优化转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球制备工艺,探究其对脂肪间充质干细胞增殖和迁移的影响。 方法：采用乳化-溶剂挥发法制备转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球,并对微球的形态、粒径大小、药物空间分布、包封率、载药量和缓释性能进行表征。将转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球溶解于PBS中,于相应的时间点检测上清液中转化生长因子β3浓度,对应时间点扫描电镜观察微球形态。将脂肪间充质干细胞分6组培养,分别加入培养基(阴性对照)、含转化生长因子β3的培养基、含空白聚乳酸-羟基乙酸微球的培养基、含10,100,1 000 g/L转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球的培养基,于对应的时间点CCK-8法检测增殖。将脂肪间充质干细胞分别与培养基(阴性对照)、含转化生长因子β3的培养基、含聚乳酸-羟基乙酸微球的培养基、含10,100,1 000 g/L转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球的培养基以非接触方式共培养24 h,检测细胞迁移数量。结果与结论：①转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球呈球形,表面光滑,无粘连,粒径均匀分布,微球直径2-50 μm,微球内的蛋白药物分布均匀,具有较高的包封率与载药量;②缓释微球具有良好的降解性能,体外可于6个月后完全降解;同时具有良好的缓释性能,体外可缓慢释放转化生长因子β3长达45 d;③空白微球及含转化生长因子β3的缓释微球对脂肪间充质干细胞增殖无影响;④空白微球对脂肪间充质干细胞的迁移无影响,转化生长因子β3及含转化生长因子β3的缓释微球可促进脂肪间充质干细胞的迁移,不同质量浓度缓释微球间的促进效果无差异;⑤结果表明,转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸缓释微球可在不影响脂肪间充质干细胞增殖的情况下促进其迁移。 ORCID: 0000-0002-2267-4589(杨振) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程     

四肢关节专用低场强MRI对前交叉韧带损伤的诊断价值

目的分析前交叉韧带损伤的MRI表现,评价四肢关节专用低场强MRI诊断前交叉韧带损伤的价值。方法应用A-torscan0·2T永磁型四肢关节专用低场强磁共振机,对40例膝关节前交叉韧带损伤患者分别采用自旋回波(SE)T1W、快速自旋回波(TSE)T2W、梯度回波(GE)T2W的矢状位、冠状位进行扫描。结果四肢关节专用低场强MRI对前交叉韧带损伤的诊断灵敏度高达100%,矢状位T1W和T2W可精确地发现前交叉韧带损伤程度。结论四肢关节专用低场强MRI是临床诊断膝关节前交叉韧带损伤的一种重要、可靠的主要检查手段。对临床医生制订手术方案有重要意义。     

旋转细胞培养系统培养的山羊软骨细胞

 目的 探讨用旋转细胞培养系统（RCCS）进行大动物软骨细胞扩增的可行性。方法 将单层培养的具有正常表型的中国山羊软骨细胞和Cytodex-3微载体放入RCCS的培养容器中,加入DMEM 培养基进行培养。在细胞培养的第3、6、9、12 天,于倒置显微镜下观察Cytodex-3微载体表面软骨细胞生长形态及增殖变化情况,并对收获的软骨细胞进行蕃红花"O"染色和Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色分析。结果 软骨细胞贴附于微载体表面生长,细胞初期呈球形、半球形凸起,逐渐向周围伸展,随时间的延长,贴附于微载体的细胞逐渐增多。收获的软骨细胞蕃红花"O"染色呈强阳性,Ⅰ型胶原染色呈阴性,Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。结论 利用RCCS可简便快速地在体外扩增羊软骨细胞,培养的软骨细胞具有正常的表型,能特异性分泌软骨组织特有的基质成分。     

计算机数据采集与处理系统在人体腰椎间盘生物力学研究中的应用

脊柱在人体肌肉骨骼系统中占有非常重要的地位,而椎间盘,特别是腰椎间盘属脊柱的薄弱环节,极易受到损伤,为疾病多发区。主要症状表现为腰、腿疼的椎间盘突出症就是一种常见病、多发病。对椎间盘突出症的力学性质作出定量的评价,不但对解决临床问题有所帮助,且对保护脊柱免受损伤的工程设计也是不可缺少的理论基础。为了研究椎间盘在复合受载状态下,其纤维环在各个方向上是怎样变形的,对椎间盘突出有何影响,以及退变与其力学性质的关系,本实验初步建立一个由微机控制多个传感器对     

粉体粒径对碳酸化羟基磷灰石水泥固化时间和压缩强度的影响

目的　检测不同粉体粒径对碳酸化羟基磷灰石水泥 (carbonatedhydroxyapatitecement,CHC)的固化时间和压缩强度的影响 ,为其修复骨缺损提供理论基础。方法　采用研磨和超细粉体技术制备 4 0 0目、6 0 0目和超细粉体粒径的CHC干粉 ,检测不同粉体粒径对CHC固化时间和压缩强度变化。结果　超细CHC干粉平均粒径为3.10 9μm ,比表面积为 2 .2 88m2 /cm3 ,在 37℃、10 0 %湿度条件下CHC固化时间随粉体粒径减小而缩短 ,而固化后压缩强度随粉体粒径缩小而升高 ,超细粉体CHC初凝时间 3min ,终凝时间 8min ,最终固化后压缩强度 (5 1.0 4 2± 3.72 8)MPa。结论　超细CHC具有原位固化性能 ,固化时间合理 ,压缩强度高 ,比较符合临床使用的要求     

骨骺软骨细胞的培养和保存方法

目的建立大量生产骨骺软骨细胞的培养方法和保存方法,为组织工程骺软骨的培养提供种子细胞。方法2周龄兔胫骨上端骨骺软骨经机械剪切和化学消化后,接种、培养及液氮冻存。通过显微镜观察其生物学表现,并通过蕃红花“O”染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色对其生物学特征进行鉴定。结果在体外观察到了骨骺软骨细胞从静止、增殖到肥大这个近似体内的生长过程,经多次传代后增殖能力降低,经过冻存的细胞生物学特征不变。蕃红花“O”和Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。结论我们成功地建立了骨骺软骨细胞的培养和冻存方法,并证明培养出的细胞是骨骺软骨细胞。     

软骨细胞形态、表型与胞间通讯的研究

背景在体外培养时软骨细胞会像成纤维细胞样成片生长并失去表型,软骨细胞胞间通讯与细胞表型的关系尚无报告.目的了解体外培养的不同形态的软骨细胞的增殖、基质合成、荧光染料摄入以及缝隙连接的关系.设计以诊断为依据的实验研究.地点和对象实验在解放军总医院骨科研究所和基础研究所完成,实验对象为兔关节软骨细胞,人股骨头软骨.干预体外培养的兔软骨细胞,分别进行苏木精-伊红(HE)、亮绿-藩红花O染色,显微镜下测量细胞大小、激光共聚焦显微镜下测量细胞内的荧光强度.激光淬灭软骨细胞内的荧光染料.主要观察指标软骨细胞的外观、细胞大小、细胞内的荧光强度.结果细胞投影面积测量软骨细胞变大,失去球形外观后增殖加快,平均面积1755.1 μm2,投影面积差别可达50倍.基质合成消失,缝隙连接消失.显微镜下软骨细胞的荧光强度测量球形软骨细胞CFDA-AM摄入多,(平均2057/30个细胞),扁平细胞摄入少(平均83/30个细胞).体外培养的球形兔软骨细胞间,人关节软骨生发层陷窝内的细胞间有胞间通讯.结论软骨细胞的密度、形态、表型和缝隙连接之间有一定的关系.而细胞外形可能决定细胞的表型.     

新鲜异体和自体骨软骨移植修复软骨缺损的差异评价

目的：通过压配技术进行移植修复，并评价新鲜异体和自体骨软骨移植修复软骨缺损的差别。方法：实验于2004—01／05在解放军总医院骨科研究所完成。采用20只成年健康新西兰兔，随机分成2组，自体移植组和异体移植组，每组10只。制备髌股关节面的股骨槽沟内直径4mm的软骨缺损的动物模型，①自体移植组在手术过程中取兔右侧关节的骨软骨块植入左侧的股骨槽沟缺损骨洞内，并与股骨槽沟软骨面平齐，闭合切口。②异体移植组在手术过程中采用组内配对将配对兔右侧膝关节取出的骨软骨块经乳酸林格氏液冲洗后，植入同组配对兔左膝的缺损内，同样将同组配对兔右膝取出的备用软骨植入配对兔左膝的缺损内。③于手术后12周观察移植后兔的关节活动度、关节腔积液情况，关节挛缩、粘连及血管翳形成情况。修复组织的质地以及周围组织和基底部的结合程度。髌骨面的退变情况。观察软骨基质分泌情况应用苏木精一伊红染色和番红O染色。缺损处修复组织的超微结构行透射电镜观察。软骨缺损的组织学评分以半定量的改良Wakitani score法评估，内容包括：细胞种类，髓质染色（易染性），表面完整性，软骨的厚度，移植软骨在受体周围组织的完整性6个方面19项内容，采用0，1，2，3，4评分，最大总分14分。结果：所有动物在实验过程中全部成活，均进入结果分析。①移植软骨情况的大体观察：异体移植组移植后局部高度及颜色已与正常软骨一致，平滑且结合紧密，与周围及基底部界限模糊且质地坚硬。关节囊正常。自体移植组移植块无陷落，无倾斜，仍然完整，厚度不变。②移植后软骨的微观结构：光镜观察可见两组移植软骨均已覆盖缺损，与正常软骨高度相当，缝隙已接近连接，细胞成熟，有大量软骨基质分泌，细胞排列规则，番红O着色深。周围无淋巴细胞和浆细胞浸润。自体移植组移植软骨与正常软骨的边缘之间形成锐利边缘的微裂，软骨基质没有能融合一体。透射电镜观察可见异体移植组见软骨细胞位于陷窝内，清晰，呈扁平状。细胞表面有多个突起，核呈椭圆形，染色质分布均匀，粗面内质网呈扩张状态，腔内有中等电子密度的分泌物，可见高尔基复合体。基质中可见胶原纤维存在。在成熟软骨细胞中可见细胞分裂象，并可见许多电子密度高的颗粒。自体移植组所见与异体移植组相同。③移植软骨的组织学评分结果：于12周观察自体移植组和异体移植组在组织学方面评分，细胞种类，髓质染色（易染性），表面完整性，软骨的厚度，移植软骨在受体周围组织的完整性评分相似，总评分相近（3．9，4．3，P=2．295）。结论：①同种关节软骨移植后可完全修复全层关节软骨缺损，软骨细胞存活，可分泌软骨基质，其形态与生物学特性类似于正常软骨细胞。（爹异体骨软骨移植后近期存活良好，并与自体骨软骨移植修复新西兰兔的全软骨缺损在组织学上相近，未见免疫排斥反应，故说明新鲜异体骨软骨也可以作为移植的供体修复骨缺损。     

人脂肪干细胞复合脱细胞软骨基质支架在生物反应器中构建组织工程软骨

目的:观察人脂肪干细胞复合脱细胞软骨基质支架在生物反应器中初步构建组织工程软骨的可行性。方法:实验于2005-04/2006-05在解放军总医院骨科研究所完成。脂肪组织和关节软骨均来自膝关节置换术中切除的组织,并经患者知情同意。关节软骨冻干后经粉碎机粉碎,过筛,选取25～38μm大小的软骨微粒。在样品中先加入2.5g/L胰蛋白酶,37℃消化24h,再加入1%Triton X-100震荡72h。将软骨微粒和蒸馏水按1∶3的比例混合后滴加在模板中,置入冷冻干燥机冻干后行紫外线交联。紫外线照射8h完成。最后经25kGy 60Co辐照灭菌完成支架制备。取膝关节置换术中切除的髌下脂肪垫,酶消法获得脂肪干细胞,扩增后复合于脱细胞软骨基质制成圆柱状三维支架上(细胞密度5×1010L-1),置于生物反应器中进行诱导培养,同时设静态培养组作为对照,3周后观测大体形态和组织学形态变化,同时进行组织化学(包括番红花O,阿利新蓝染色)和Ⅱ型胶原免疫组织化学分析。结果:生物反应器组诱导培养3周苏木精-伊红染色显示支架结构消失,只有中心区域残存少量支架结构;静态培养组支架结构尚存在,有少量基质分泌。番红花O染色显示生物反应器组细胞外有大量蛋白聚糖沉积,阿利新蓝染色表明有软骨特异性蛋白多糖的聚集;而静态培养组只有部分区域染色且淡于生物反应器组。Ⅰ型胶原免疫组化的结果显示,在生物反应器组细胞能够合成大量软骨细胞特异性胶原成分,而静态培养组呈弱阳性。结论:生物反应器培养明显促进了脂肪干细胞的增殖与软骨分化,是体外构建组织工程软骨的良好方法。     

人脱细胞软骨细胞外基质对异种软骨种子细胞的影响

目的观察人脱细胞软骨细胞外基质(hACAM)对异种兔软骨种子细胞增殖和表型的影响。方法将差速梯度离心法制作的人脱细胞软骨细胞外基质,配制成0.5%的浆料,分别铺于6孔细胞培养板和96孔细胞培养板,形成1 mm厚的薄膜,以此培养板为实验组。空白对照组培养板仅使用单纯培养液培养。在培养板上培养兔关节软骨细胞。通过hochest33258染色验证人软骨细胞外基质脱细胞完全与否;分别在第5、15天两个时间点,通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色观察两种培养方法的兔软骨细胞的生长形态、细胞表型和增殖情况,用CCK-8细胞增殖实验比较两种培养方法在第1、3、7、10天的增殖情况。结果通过hochest33258染色发现差速梯度离心的人软骨细胞外基质脱细胞完全。通过倒置显微镜观察第5和15天的实验组细胞增殖情况优于空白对照组,甲苯胺蓝染色的结果也证明这个观点;CCK-8细胞增殖试验显示第7天hACAM组在细胞增殖方面明显地优于单纯培养液的对照组(P=0.0298),hACAM组的软骨细胞与空白组的软骨细胞在第10天的增殖情况相比没有统计学差异。结论 hACAM免疫原性低,无细胞毒性,能够很好地促进异种软骨细胞的增殖。