ITAC转染乳腺癌细胞系4T1的体内外生物学行为研究

目的:观察转染ITAC对乳腺癌细胞系4T1体内及体外生物学行为的影响。方法:构建pcDNA3-ITAC真核表达质粒,基因转染的方法建立稳定表达ITAC的乳腺癌细胞系ITAC-4T1。体外及体内观察ITAC-4T1细胞的生长情况。RT-PCR检测肿瘤组织ITACmRNA转录水平。杀伤实验检测脾细胞杀伤活性,FACS检测CD8 T细胞IFN-γ的分泌。结果:体外ITAC-4T1细胞的生长与未转染及转染空载体的4T1细胞没有差别(P>0.05)。体内ITAC-4T1细胞形成的肿瘤生长较对照组明显减慢(P<0.05)。ITAC-4T1肿瘤组织检测到较高水平的ITACmRNA转录(P<0.01)。接种ITAC-4T1细胞的小鼠脾细胞杀伤率显著高于对照组(P<0.05),CD8 T细胞IFN-γ分泌明显增加(P<0.05)。结论:ITAC基因转染可以抑制4T1细胞体内生长,与ITAC诱导Th1型细胞免疫应答,增强效应细胞特异性杀伤活性相关。     

小鼠3LL肿瘤局部高表达GM-CSF增强抗肿瘤免疫的实验研究

背景与目的:粒-单核细胞集落刺激因子(grannulocyte/monocyte-colony stimulating factor,GM-CSF)具有促进未成熟树突状细胞(dendritic cell,DC)成熟、上调其MHC分子和协同刺激分子表达以及增强DC对肿瘤抗原的提呈等作用.本文研究GM-CSF在肿瘤局部的高表达可以促进肿瘤局部DC成熟及亚群改变,从而诱导增强的抗肿瘤免疫效应.方法:以GM-CSF转染小鼠Lewis肺癌细胞株3LL获得3LL-GM,分别以3LL、3LL-vec(空载体对照)和3LL-GM细胞接种C57BL/6小鼠,分离肿瘤局部免疫细胞,流式细胞术检测DC成熟度、DC亚群比例、CD8 效应T细胞的活化及其功能.结果:3LL-GM肿瘤局部GM-CSF浓度高达441.22 ng/g肿瘤组织,显著高于母本3LL组的0.53 ng/g肿瘤组织(P<0.05)和空载体对照3LL-vec组的0.42 ng/g肿瘤组织(P<0.05).在3LL-GM、3LL和3LL-vec组小鼠肿瘤内浸润的CD11c DC细胞中,I-Ab 细胞的比例分别为60.62%、19.98%和23.12%(P<0.05),CD80 细胞的比例分别为60.93%、37.43%和47.03%(P<0.05),表明肿瘤局部GM-CSF促进DC成熟;同时,三组小鼠肿瘤内浸润的CD11c CD8α CD4-DC亚群比例分别为60.82%、40.00%和29.27%(P<0.05),显示肿瘤局部GM-CSF促使DC分化为CD11c CD8α CD4-亚群.3LL-GM组小鼠肿瘤内浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)中,CD3 CD62Llow细胞比例高达20.84%,显著高于3LL组的6.34%(P<0.05)和3LL-vec组的15.18%(P<0.05);并且分泌IFN-γ的CD8 T淋巴细胞比例为2.77%,与对照组相比差异具有显著性(P<0.05).结论:肿瘤局部高表达GM-CSF,可通过提高DC成熟度及上调CD11c CD8α CD4-DC亚群在肿瘤局部的比例,诱导增强的抗肿瘤免疫效应,最终导致肿瘤消退.     

B细胞表位基因疫苗诱导特异性免疫应答及特性研究

为研究特异性B细胞表位短肽为基础的DNA疫苗的免疫应答特性,将鸭乙肝病毒Pre-S中的P127-138B细胞表位基因克隆到含多肽表达盒(peptideexpressioncassette,PEC)的载体中,体外转染C2C12肌肉细胞,用DOT-EIA检测表位短肽的表达,进一步分别免疫不同品系的BALB/c和C57BL/6小鼠,比较MHC限制性对免疫应答的影响。结果表明,重组pECk-b1b2载体可在体外瞬时高效表达,并保持原有的免疫活性;体内基因免疫能诱导针对表位短肽的特异性抗体;不同品系小鼠抗体产生动力学相似,但抗体滴度差异显著。这些结果提示,以B细胞表位为基础的基因免疫可诱导特异性免疫应答,为DNA疫苗的分子设计提供了新的思路和应用前景。     

BALB/c小鼠胸腺细胞发育模型的建立

目的建立胸腺细胞体外研究模型,为T细胞早期发育及相关实验提供有效技术平台。方法无菌摘取14.5天龄胚鼠胸腺,胸腺器官体外培养,FACS检测不同培养时间点细胞存活状况和表型变化,计数每个胸腺小叶的细胞数变化。结果胸腺体外培养显示:经过6d的培养,胸腺细胞存活率均在88.0%以上,由双阴性发育至双阳性细胞,CD4+CD8+双阳性细胞由培养第0天的0上升到第6天的89.07%;细胞数量随胸腺发育(培养时间的增加)而增多,每个胸腺小叶胸腺细胞数量也由培养0d的0.75×104个上升到第6天的1.38×106个。而体内数据显示:胸腺细胞由胚龄14.5d的双阴性阶段发育到新生鼠的双阳性阶段,每个胸腺小叶细胞数量由14.5d的0.75×104个上升到新生鼠的2.56×106个,同时间段CD4+CD8+双阳性细胞比例由0上升到91.22%。体内、外胸腺细胞表型、数量变化趋势一致。结论体外培养状态下胸腺细胞数量和表型变化与体内自然变化趋势一致,在体外培养可以模拟体内胸腺细胞由双阴性到双阳性的发育过程,这将为T细胞发育的研究提供简易、有效的技术平台。     

灭活肿瘤细胞免疫小鼠诱生的自身抗体及其作用探讨

目的探讨灭活肿瘤细胞免疫诱导机体产生抗dsDNA自身抗体及该自身抗体与抗肿瘤效应的关联性。方法以灭活SP2／0肿瘤细胞3次免疫Balb／c小鼠,末次免疫2周后采血,ELISA法检测血清中抗dsDNA自身抗体的表达水平。进一步用自身或不同来源的肿瘤细胞攻击经灭活SP2／0免疫的Balb／c小鼠,观察免疫保护效应;或以免疫血清与肿瘤细胞共孵育后接种小鼠,观察肿瘤生长和生存。结果灭活肿瘤细胞免疫小鼠可诱导产生较高滴度的抗dsDNA自身抗体。体内攻击实验表明：抗dsDNA自身抗体滴度的降低与肿瘤细胞攻击后小鼠肿瘤生长呈负相关,免疫血清与肿瘤细胞孵育后接种小鼠可明显延缓小鼠的成瘤时间,延长生存期。结论灭活肿瘤细胞免疫小鼠诱生的抗dsDNA自身抗体与体内抗肿瘤效应具有关联性。     

CD40L在M2型巨噬细胞类型转换中的作用

 目的 检测不同CD40L表达水平的脾细胞对巨噬细胞表型和功能的影响,探讨通过调控CD40L的表达改变巨噬细胞的类型。方法 贴壁分离正常BALB/c小鼠的腹腔巨噬细胞。将腹腔巨噬细胞或经IL-4刺激的腹腔巨噬细胞,分别与体外培养2日后获得的CD40Llow脾细胞和Ionomycin与PMA诱导的CD40Lhigh脾细胞共孵育,24h后检测M1和M2型巨噬细胞相关基因的表达,并以硝酸还原酶法检测NO分泌水平。结果 与CD40Llow脾细胞共孵育的巨噬细胞CCL22、Fizz1和Ym1表达水平较高,但只分泌较低水平的NO,而与CD40Lhigh脾细胞共孵育的巨噬细胞表达较高水平的CCL3并分泌高水平的NO,而且CD40Lhigh脾细胞可使M2型巨噬细胞表型相关基因明显下调。结论 CD40Lhigh脾细胞使巨噬细胞倾向于M1型极化,并且能使M2型巨噬细胞向M1型转换。     

一株抗双链DNA单克隆抗体的制备及其特性研究

制备抗双链DNA(dsDNA)单克隆抗体并对其生物学特性进行初步研究。以活化淋巴细胞的DNA为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体;用体内诱生法制备腹水,以间接酶链反应吸附试验(ELISA)法分析抗体的亚类、特异性和亲和力;用免疫荧光法检测抗体的荧光核型;用考马斯亮蓝法检测注入杂交瘤细胞的小鼠的尿蛋白含量。结果显示,成功获得了1株持续稳定分泌抗dsDNA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为6C2;该细胞株所分泌的抗体亚类为小鼠IgG2a,能特异性结合dsDNA,亲和力常数为2.67×10~8mol/L,免疫荧光核型为均质型;将6C2细胞注入正常BALB/c小鼠腹腔后,小鼠的尿蛋白含量较对照组明显增高。结果表明,抗dsDNA单克隆抗体6C2是致病性抗体,对于进一步研究抗dsDNA抗体的致病机制具有重要的价值。     

体外诱导大鼠骨髓基质细胞向心肌细胞的分化

目的　通过体外诱导研究骨髓基质细胞 (MSC)向心肌样细胞的分化和心肌细胞特异性标志的表达。方法　抽取雄性SD大鼠骨髓 ,进行体外培养和连续传代 ,获得较纯的MSC。采用第 8代的MSC ,以去甲基化药物 5 氮杂胞苷进行体外诱导 ,相差显微镜下观察其形态变化 ,通过流式细胞仪 (FACS)分析细胞形态比例 ,以免疫组化方法鉴定心肌特征性蛋白Desmin和肌钙蛋白T(cTnT)表达 ,并通过RT PCR鉴定心肌特异因子基因的表达。结果　诱导前MSC多呈扁平多突起形态 ,诱导后形态发生变化 ,10d细胞呈长梭形 ,2 0d后细胞之间形成连接 ,排列方向渐趋一致 ,1月时出现肌管样结构。FACS检测发现诱导后MSC形态构成发生变化 ,以形态较小细胞为主。免疫组化检测Desmin阳性比例近 35 % ,有cTnT免疫荧光阳性细胞出现 ,约占 10 %。RT PCR显示诱导后MSC后有GATA 4、ANP和a MHC基因表达。结论　成体中的MSC在一定诱导条件下可以表现心肌样特征 ,是临床心肌细胞成形术理想的移植细胞     

Toll样受体与动脉粥样硬化

固有免疫应答与动脉粥样硬化斑块形成有关.固有免疫识别中的模式识别受体Toll样受体信号通路与动脉粥样硬化发病机理的关系,解释了针对外来病原体的非特异性防御以及内源性炎症分子导致动脉粥样硬化的可能机制.     

MicroRNA-7对非小细胞肺癌表柔比星化疗的增敏作用

目的:研究microRNA-7(miR-7)对非小细胞肺癌A549和H1299细胞表柔比星(epirubicin,EPI)化疗的增敏作用及其机制。方法:EPI、miR-7 mimics单独或联合处理A549和H1299细胞后,CCK-8法检测A549和H1299细胞的增殖,Annexin-V/PI染色流式细胞术检测A549和H1299细胞的凋亡,实时定量PCR检测A549和H1299细胞中EGFR及Raf-1mRNA的表达。结果:单独使用EPI或转染miR-7 mimics均可抑制A549和H1299细胞的增殖(P<0.05),而转染miR-7 mim-ics后再以50～400 ng/ml EPI处理,较单独EPI处理显著增强对A549和H1299细胞增殖的抑制作用(P<0.05)。当miR-7mimics与EPI联用时,A549和H1299细胞的凋亡率则分别较EPI单独处理组增加(54.9±0.4)%和(67.2±0.5)%(均P<0.01),且伴随EGFR及Raf-1 mRNA表达量的显著下降(P<0.01),A549细胞中分别降低(68.0±6.0)%和(78.2±3.9)%,H1299细胞中分别降低(94.8±6.2)%和(87.8±4.3)%。结论:miR-7可通过下调EGFR及Raf-1 mRNA的表达,协同EPI抑制非小细胞肺癌A549和H1299细胞的增殖,并促进细胞凋亡。