重组空肠弯曲菌PEB1蛋白的大量表达及其鉴定分析

目的 探讨基因工程菌PEB1 E.coli BL21(DE3)大量表达重组空肠弯曲菌PEB1蛋白的稳定性及其纯化方法并鉴定.方法 诱导培养工程菌E.coli BL21(DE3)表达重组空肠弯曲菌PEB1蛋白,经镍琼脂糖凝胶层析柱纯化,透析后通过SDS-PAGE分析纯化后的重组空肠弯曲菌PEB1蛋白分子量大小.结果 挑取的PEB1 E.coli BL21(DE3)单个菌落,经总共17 h的扩增,细菌总数可达1×1010以上.在咪唑浓度为100,200,300 mmol/L时,洗脱液中重组蛋白的含量较高,分子量在31KD左右.结论 基因工程菌PEB1 E.coli BL21(DE3)可大量稳定表达重组空肠弯曲菌PEB1蛋白,经鉴定与空肠弯曲菌外膜蛋白-PEB1蛋白分子量相同.     

空肠弯曲菌PEB1重组蛋白的表达及单克隆抗体的制备

目的表达CJPEB1重组蛋白,制备并鉴定CJ PEB1蛋白的单克隆抗体。方法诱导培养工程菌E．co-liBL21（DE3）表达CJPEB1重组蛋白,以PEB1蛋白溶液与等体积的佐剂完全乳化作为免疫原常规免疫BALB／C小鼠,制备单克隆抗体。无菌取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0进行融合,建立杂交瘤细胞株。将建株的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水制备抗体,应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测腹水中抗体的效价,应用Western-blot和玻片凝集试验检测抗体的特异性。结果得到高纯度的CJPEB1重组蛋白,蛋白质分子量大小与预计的理论值相符。获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。两株杂交瘤细胞诱生的腹水,经间接ELISA法检测,腹水中的抗体效价分别为8×10^4和5×10^4,经双向琼脂扩散试验检测效价均为1：16。通过Westem-blot鉴定,两株杂交瘤细胞分泌的抗体均与PEB1蛋白特异性地结合;其诱生的腹水与CJ菌液混合出现凝集现象,而与大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌等菌液混合均未出现凝集现象。结论成功建立了两株稳定分泌抗CJPEB1重组蛋白抗体的杂交瘤细胞株并制备了抗CJPEB1蛋白的单克隆抗体,为今后研究多种检测CJ的方法创造了条件。     

人脐血间充质干细胞分离培养方法的优化

目的探索脐血来源的间充质干细胞体外分离培养的更优方法。方法无菌条件下抽取正常足月剖宫产胎儿的脐带血,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞。50份脐血分为对照组和改良组,每组25份,分别以1.5×10^7/ml的细胞密度接种于25 cm^2培养瓶中。对照组贴壁3 d后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液;改良组贴壁0.5 h后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液。结果对照组杂细胞较多,最终成功培养出8份脐血间充质干细胞;改良组杂细胞较少,最终成功培养出18份脐血间充质干细胞。经流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的免疫表型,结果显示,所培养出的脐血间充质干细胞不表达或极弱表达CD34、CD106等造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞相关的表面抗原标记物。结论采取脐血单个核细胞贴壁0.5 h弃上清更换新鲜培养液可以明显提高脐血间充质干细胞的培养成功率,其结果优于脐血单个核细胞贴壁3 d弃上清更换新鲜培养液。     

血清体积分数对人细胞因子诱导杀伤细胞增殖的影响

背景：细胞因子诱导的杀伤细胞的培养多采用体积分数10%的血清,但关于血清体积分数对其生长特性的影响少有报道。目的：观察细胞因子诱导的杀伤细胞在不同血清体积分数培养液中的增殖情况。方法：分别配制血清体积分数为10%,20%和30%＋重组人白细胞介素2等细胞因子的完全培养液培养人细胞因子诱导的杀伤细胞,使用流式细胞仪分析血清体积分数对细胞周期的影响,通过MTT法检测细胞因子诱导的杀伤细胞在不同血清体积分数培养液中的增殖,并观察细胞因子诱导的杀伤细胞的生长状态。结果与结论：细胞因子诱导的杀伤细胞在体积分数10%血清培养液中增殖速率和增殖指数均最低,在体积分数30%血清培养液中最高,3组细胞的不同时间点的增殖速率差异均有显著性意义（P〈0.05或P〈0.01）。结果证实,体外培养的细胞因子诱导的杀伤细胞的增殖具有血清体积分数依赖性,高血清体积分数培养液的促细胞因子诱导的杀伤细胞增殖效应明显。     

树突细胞联合CIK杀伤肺癌细胞的实验研究

目的 研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与同源性树突细胞(DC)共同培养后增殖活性和细胞表型的变化,以及对SPC-A-1人肺癌细胞的杀伤作用.方法 通过采集健康志愿者外周血分离单个核细胞(PMBC),根据黏附特性的不同将贴壁细胞诱导为成熟的DC,同时将非黏附细胞诱导分化为CIK,在培养第9 d时将DC和CIK细胞按1∶20混合共培养3 d,同时以单纯CIK细胞为对照,运用LDH释放法检测对SPC-A-1的杀伤活性.结果 DC-CIK共培养后的增殖速度快于单纯的CIK细胞,培养12 d时CIK和DC-CIK的CD3+CD8+,CD3+CD56+双阳性率分别为51.2%±6.6%,21.4%±4.2%及70.7%±5.9%,39.6%±4.7%,表达差异有统计学显著性意义(P<0.001).在5∶1～20∶1效靶比范围内,DC-CIK对肺癌细胞的杀伤活性高于CIK(P<0.05),且随效靶比增加,杀伤活性增强.结论 DC-CIK的增殖活性和杀伤活性均高于单纯的CIK细胞.     

直肠癌患者外周血单核细胞诱导为树突细胞

目的 用直肠癌患者外周血单核细胞通过体外培养的方法诱导为成熟树突细胞.方法 CS-3000血细胞分离机采集直肠癌患者外周血单核细胞悬液,Ficoll分离单个核细胞,用含10%FBS的RPMI-1640培养基培养,第0天加入GM-CSF 1 000 U/ml、IL-4 500 U/ml,第4天2/3量换液,补足GM-CSF、白介素(IL)-4,并加入肿瘤坏死因子(TNF)-α 500 U/ml诱导其成熟,以后每隔3天2/3量换液.结果 培养至第11天,收集培养的1×105～2×105个树突细胞经流式细胞仪检测表达CD83+(52.9±5.8)%,CD86+(79.2±8.1)%,HLA-DR(65.8±5.7)%,CD1a(51.3±6.4)%,及CD+14(4.72±2.16)%.结论 直肠癌患者外周血单核细胞经GM-CSF、IL-4及TNF-α联合培养能诱导出成熟树突细胞.为直肠癌的免疫治疗提供了临床应用基础.     

密度梯度离心法分离脐血单个核细胞方法的优化

目的 对密度梯度离心法分离脐血单个核细胞的方法进行优化,以提高该方法分离脐血单个核细胞的收率.方法 脐血40份,每份40 ml,分为常规组和优化组,每组20份.常规组脐血与NS1∶1混合稀释后,直接通过Ficoll分离液分离单个核细胞;优化组通过先将脐血洗涤一次,加入等量NS充分吹打混匀,200目筛网过滤,保持细胞悬液和Ficoll分离液1:1的体积比进行分离操作.对每份分离得到的脐血单个核细胞通过白细胞稀释液稀释后计数.结果 常规组分离后的白膜层有11份界面不清晰,同时均混有少量的红细胞.优化组分离后的白膜层有1份界面不清晰,仅有极少的红细胞混入.两种方法收集的脐血单个核细胞数比较,优化组多于常规组(P＜0.01).结论 通过对密度梯度离心法的步骤进行优化,可提高脐血单个核细胞的分离效果.     

血清体积分数对人细胞因子诱导杀伤细胞增殖的影响

背景：细胞因子诱导的杀伤细胞的培养多采用体积分数10%的血清,但关于血清体积分数对其生长特性的影响少有报道。 目的：观察细胞因子诱导的杀伤细胞在不同血清体积分数培养液中的增殖情况。 方法：分别配制血清体积分数为10%,20%和30% +重组人白细胞介素2等细胞因子的完全培养液培养人细胞因子诱导的杀伤细胞,使用流式细胞仪分析血清体积分数对细胞周期的影响,通过MTT法检测细胞因子诱导的杀伤细胞在不同血清体积分数培养液中的增殖,并观察细胞因子诱导的杀伤细胞的生长状态。 结果与结论：细胞因子诱导的杀伤细胞在体积分数10%血清培养液中增殖速率和增殖指数均最低,在体积分数30%血清培养液中最高,3组细胞的不同时间点的增殖速率差异均有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)。结果证实,体外培养的细胞因子诱导的杀伤细胞的增殖具有血清体积分数依赖性,高血清体积分数培养液的促细胞因子诱导的杀伤细胞增殖效应明显。     

外周血干细胞移植对动物肢体局部化脓性感染的影响

目的:探讨自体外周血干细胞移植对动物下肢动脉缺血组织手术切口的局部抗化脓性感染效果。方法:对正常动物和糖尿病模型动物分别进行外周血干细胞动员,然后经手术形成下肢动脉缺血模型后分别进行干细胞移植的分组观察。2周内观察动物手术后切口出现的化脓性感染情况。结果:只进行外周血干细胞动员的动物,手术后右下肢局部发生化脓性感染率比较高;而外周血干细胞动员后再进行外周血干细胞移植的动物,感染率明显下降(P<0.05)。糖尿病模型实验动物的这种感染率更高,在不使用抗菌素的情况下,手术后右下肢大多出现了感染(P<0.05)。结论:外周血干细胞移植可明显提高动物缺血肢体的局部抗化脓性感染能力,而对于糖尿病动物,这种抗感染能力则会明显下降。     

二次外周血干细胞移植改善兔肢体缺血的实验研究

目的建立兔肢体缺血模型,观察二次外周血干细胞移植对肢体缺血的治疗效果。方法连续4 d皮下注射7.5μg/kgG-CSF进行干细胞动员,分离外周血单个核细胞制成干细胞悬液。制备兔肢体缺血模型,将干细胞悬液分10～12个点注射于手术切口两侧肌肉,实验组动物于移植后第18天重复进行干细胞动员并在第22天进行第二次干细胞移植。结果术后多普勒超声显示手术肢体的血液供应阻断,模型制备成功。1周后检测侧支循环开始建立,实验6周后,二次移植兔缺血部位肌肉毛细血管密度平均为26.1个,单次移植兔为20.9个,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论二次外周血干细胞移植能更好地改善肢体缺血。