兔骨髓基质细胞体外培养、诱导及分化成神经干细胞的实验研究

目的研究新西兰大白兔骨髓基质细胞体外培养及诱导分化情况. 方法梯度密度离心法分离新西兰大白兔骨髓基质细胞( BMSCs),于体外用神经干细胞培养基和多种细胞因子进行培养、诱导、分化,细胞免疫化学方法进行鉴定. 结果新西兰大白兔骨髓基质细胞能在体外培养中增殖、分化,具有克隆能力的骨髓基质细胞能表达干细胞特异性抗原神经巢蛋白 (Nestin),这些细胞最终能分化出类神经元样细胞,免疫细胞化学检测可见有神经核蛋白抗体( NeuN)的表达. 结论新西兰大白兔骨髓基质细胞是具多向分化潜能的细胞,具有较强的增殖、自我更新能力.在适宜的条件下,可以分化成能表达神经系细胞特异性抗原的细胞.骨髓基质细胞来源方便、取材较容易,体外培养和扩增的技术条件简便,具有向神经系细胞分化的潜能,可以考虑作为细胞移植治疗的种子细胞.     

脑瘫患儿留置针穿刺技巧

脑瘫发病率按出生人口统计报告我国为4‰,中国目前有超过500万脑瘫患儿,这给家庭和社会都带来沉重的负担。患儿表现为运动障碍、姿势异常,伸张反射亢进、不协调是本型特征。     

术前手术人路设计在立体定向干细胞移植术中的应用

目的 评价术前手术人路设计在立体定向干细胞移植术中的作用及意义. 方法 选择6例行立体定向干细胞移植术的基底节区脑卒中患者,手术前通过MR检查设计移植靶点及入颅点,使两者间连线避开脑组织重要功能区、脑室系统及软化灶,术后通过MR检查观察实际移植靶点及手术入路与术前设计是否符合. 结果 术后复查MR,常规扫描显示实际移植靶点与术前设计靶点基本符合,SWI序列显示实际手术人路与术前设计相符合. 结论 术前手术人路设计不仅能保证细胞精确移植到预定靶点,保证了细胞移植的疗效,而且手术入路能成功避开重要脑组织结构、脑室系统和软化灶,减少了手术的创伤.     

USPIO标记大鼠骨髓源性神经干细胞移植脑皮层影像及形态学初步研究

目的将超小超顺磁性氧化铁（USPIO）Sinerem标记的大鼠骨髓源性神经干细胞移植鼠脑后，初步观察其在大脑中的活性、迁移和整合情况，确定MRI成像示踪Sinerem标记神经干细胞的可行性。方法分离SD大鼠骨髓基质细胞，体外培养诱导成骨髓源性神经干细胞。将Sinerem氧化铁和神经干细胞共孵育培养过夜。采用普鲁士蓝染色和透射电镜确定细胞内铁的摄取、定位情况。将标记细胞立体定向移植微注射到大鼠脑皮层。在不同时间点以SE序列T2WI行4．7T磁共振干细胞成像示踪，然后用组织学方法观察标记细胞在脑内的转归情况。结果Sinerem标记神经干细胞效率为98％～100％，普鲁士蓝染色显示铁颗粒存在胞质中，电镜显示铁颗粒集中于内涵体／溶酶体中；移植细胞体内的T2WI信号强度明显降低．可在4周时检测到细胞沿胼胝体迁移；组织学检测结果表明标记后的细胞可在脑内存活，并能沿神经纤维迁移。结论USPIO能有效地标记骨髓源性神经干细胞，利用磁共振成像可进行大脑中活体示踪监测。     

兔骨髓基质细胞Feridex标记及体外MRI成像的实验研究

目的使用超顺磁性氧化铁菲立磁（FE）和转染试剂多聚赖氨酸（PLL）对骨髓基质细胞（BMSCs）进行体外标记．并在体外对标记细胞进行MRI示踪，确定其标记BMSCs的适宜浓度。方法使用不同浓度（10、25、50、75μg／mL）的FE复合PLL，形成FE-PLL并标记新西兰大白兔BMSCs后，分为5组（A：纯BMSCs组；B：5μg／mLFE＋0．75μg／mLPLL组；C：12．5μg／mLFE＋0．75μg／mLPLL组；D：25μg／mLFE＋0．75μg／mLPLL组；E：37．5μg／mLFE＋0．75μg／mLPLL组）。对各组细胞分别进行普鲁士蓝染色、流式细胞仪检测、透射电镜观察．检测FE-PLL标记兔BMSCs的效率及其对凋亡的影响。体外扫描采用4．7TMR机，扫描序列为轴面T2WI。结果FE可以高效率标记BMSCs，被标记的细胞显微镜下呈淡黄或深黄，颜色的深浅与所加FE的剂量呈正相关；胞质内散在分布许多含膜的囊泡样包涵体结构．囊泡内有浓聚细小的铁颗粒．从B组～E组依次增多。流式细胞仪结果显示，5、12．5、25μg／mL各组FE对细胞无不良影响，而37．5μg／mL组凋亡细胞明显增加。体外4．7TMRI显示未标记组无信号改变，呈显著高信号．标记组随FE浓度的增高信号改变增大，信号降低的越明显。结论FE可以用来体外标记兔BMSCs．在适宜浓度下对其生物学活性无明显影响。并能在MRI下达到示踪的目的。     

骨髓间充质干细胞移植对小儿脑瘫患者粗大运动功能的影响

目的:采用粗大运动功能评定(GMFM)量表评价骨髓间充质干细胞移植(BM-MSCs)对小儿脑瘫患儿粗大运动功能的影响.方法:采用开放性自身对照法.对24例脑瘫患儿实施试验研究,其中男13例,女11例,年龄0.5～12岁;痉挛型13例,徐动型8例,混合型3例;术前GMFCS评分Ⅳ级18例、Ⅴ级6例.入院后查体无禁忌证者行自体BM-MSCs移植,方法为经头立体定向干细胞移植和腰穿蛛网膜下腔注射干细胞移植,分别于移植前及移植后12个月内评估粗大运动功能.结果:24例受试者均顺利完成临床研究.其术后1个月、6个月及12个月的GMFM总分及A、B、C功能区得分均较移植前显著提高(P＜0.01);在移植后1个月时D、E功能区得分较移植前略有提高,这两个区的得分在移植后半年和1年时与移植前相比均显著提高(均P＜0.05);移植后半年的GMFM总分较术后1个月时显著提高(P＜0.05).患儿的年龄、性别对移植的疗效无显著性影响,发病类型、手术方式对疗效影响显著.结论:BM-MSCs移植治疗小儿脑瘫是安全、有效、可行的,可改善脑瘫患者的大运动功能,疗效以术后半年最明显.     

脐带间充质干细胞移植治疗脑瘫患儿流涎症疗效观察

 目的 探讨应用脐带间充质干细胞移植治疗脑瘫患儿流涎症的疗效。方法 25例脑瘫合并流涎症患儿被随机分入实验组和对照组。实验组每位患儿接受4次腰椎穿刺干细胞移植术,对照组不给予任何手术及药物干预治疗,实验组于移植前及移植后1、3、6个月进行流涎频率及严重程度评分(SF)、唾液称重(W)、流涎商测定(DQ)。对照组于入组时及入组后1、3、6个月分别行SF、W、DQ评定。结果 实验组与对照组相比较,实验组SF、DQ在术后1、3、6个月均明显低于对照组(P<0.05),差异具有统计学意义;SF指标显示术后1、3、6个月治愈率分别为61.54%、23.08%、23.08%;DQ指标显示术后1、3、6个月治愈率分别为69.23%、46.15%、23.08%;SF、DQ术后1、3、6个月有效率均为69.23%。W指标显示术后1、3个月,实验组明显低于对照组(P<0.05),差异具有统计学意义,术后1、3个月实验组治愈率分别为69.23%、38.46%,有效率均为69.23%;术后6个月实验组与对照组差异不具有统计学意义,但实验组患儿个体比较,术后6个月与术前相比治愈率为23.08%,有效率为69.23%。结论 脐带间充质干细胞移植可以显著改善脑瘫患儿流涎症,从而提高患儿生活质量。     

超顺磁性氧化铁对大鼠神经干细胞生物学活性的影响

目的 初步研究利用超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓基质细胞来源的神经干细胞及其对细胞活力、增殖等生物学活性的影响,并确定最佳标记浓度.方法 无菌条件下取大鼠股骨骨髓,梯度密度离心法分离得到骨髓基质细胞.体外培养、诱导成神经干细胞,使用不同终浓度的(6.25、12.5、25、37.5、50μg/ml)Ferumoxides(超顺磁性氧化铁)标记神经干细胞,采用普鲁士蓝染色、MTT法、流式细胞仪、透射电镜等方法鉴定Ferumoxides标记神经干细胞的效率及对细胞活力、增殖等生物学特性的影响.结果 Ferumoxides可以高效率标记神经干细胞,标记效率在90%以上.普鲁士蓝染色显示标记的神经干细胞胞质内存在细小蓝色铁颗粒,细胞呈淡蓝至深蓝色,颜色的深浅与所加Ferumoxides的剂量成正相关.电镜结果显示标记的神经干细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡,主要集中在胞体上.当Ferumoxides终浓度高于25 μg/ml时,Ferumoxides颗粒在细胞内聚集成团块状,量较多,在一定程度上影响了细胞超微结构的观察;低于25 μg/ml时,Ferumoxides颗粒散布于细胞胞质内,并随着浓度的降低,Ferumoxides颗粒在胞质内分布越分散,量越少.MTT及流式细胞仪结果显示Ferumoxides终浓度大于25 μg/ml时则对细胞活力、增殖、凋亡有一定影响,小于等于25 μg/ml时对细胞活力、增殖无明显影响.结论 利用Ferumoxides在体外标记神经干细胞是一种可行的实验方案,其最佳终浓度为25 μg/ml.     

大鼠骨髓源神经干细胞的Sinerem体外标记及磁共振成像研究

目的 应用超小超顺磁性氧化铁(USPIO)Sinerem和转染试剂多聚赖氨酸(PLL)复合物标记大鼠骨髓源神经干细胞,初步评价磁共振成像活体示踪Sinerem标记干细胞的可行性.方法 分离SD大鼠骨髓基质干细胞,体外培养诱导成骨髓源神经干细胞.将制备的Sinerem-PLL复合物以浓度Sinerem 200μg/ml和干细胞共孵育培养过夜.采用普鲁士蓝染色和透射电镜确定细胞内铁的摄取、定位情况;并对细胞增殖、凋亡检测评价.体内外以SE序列T2WI与T2*WI行4.7T磁共振干细胞成像.结果 该方法标记干细胞效率为95%以上,普鲁士蓝染色显示铁颗粒存在胞质中,电镜显示铁颗粒集中于内涵体和溶酶体中;该浓度时Sinerem对细胞的活性影响与未标记细胞相比差异无统计学意义(P＞0.05).标记后细胞体内外的T2WI与T2*WI信号强度明显降低.结论 利用Sinerem对比剂经PLL介导标记骨髓源神经干细胞高效易行,磁共振可用于活体示踪神经干细胞.     

兔骨髓间充质干细胞低氧培养及基本性质研究

目的探讨体外低氧浓度培养条件对于新西兰大白兔骨髓问充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM—MSCs）增殖、分泌等特性的影响。方法将细胞分为低氧浓度培养组及对照组,分别检测其细胞表面标志物表达、分化能力、生长曲线、克隆形成能力,并使用ELISA法检测两组胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）分泌量的区别。结果低氧浓度培养组细胞在表面标志物表达及分化能力上均与对照组无明显区别,而增殖能力及克隆形成能力较对照组明显增强,经ELISA检测,低氧浓度培养条件下的细胞GDNF的分泌量更高。结论低氧浓度的培养条件有利于BM—MSCs增殖及分泌能力增强,适宜用于BM—MSCs的扩增。