糖尿病脑病机理的再探讨及APP17肽的作用

目的：检测糖尿病小鼠脑内Tau蛋白不同位点的磷酸化状态及β淀粉样肽表达的改变,进一步探讨糖尿病脑病的机理并观察APP17肽的作用。方法：用链脲佐菌素诱发小鼠糖尿病模型,并皮下注射,APP17肽进行保护。4周后,取小鼠脑组织做BT－2、Rlle免疫组织化学染色,另一部分小鼠断头取脑,分离海马,做Tau-1,AT-8,A β1－16和管蛋白（tubulin)抗体蛋白免疫印迹。结果：糖尿病小鼠脑海马神经元内正常Tau蛋白含量减少,Tau蛋白192／202位点及194／198位点过度磷酸化,而Thr231和Thr181位点未被磷酸化;管蛋白的表达明显减少,而APP的表达则增多,用APP17肽对糖尿病小鼠进行保护后,Tau蛋白的磷酸化程度降低,APP和Tubulin的表达恢复到接近正常水平。结论：糖尿病小鼠脑内Tau蛋白过度磷酸化、tubulin表达减少,微管结构受损,同时APP表达增加造成Aβ含量增多,引起神经元损害,对糖尿病小鼠应用APP17肽使Tau保持磷酸化程度、APP及tubulin表达接近正常,因此,APP17肽在防止神经元变性方面有重要意义.     

Nogo与Nogo受体在正常小鼠大脑的分布

NOgo与NOgo受体对抑制中枢神经系统的再生有着重要的作用。本研究用本室制备的抗Nogo和抗Nogo受体的多克隆抗体进行免疫组织化学染色,在低倍镜下计数阳性细胞、观察Nogo与Nogo受体在正常小鼠脑内的分布。结果显示:Nogo样和Nogo受体样免疫阳性结构在大脑皮层、海马、下丘脑、苍白球、尾壳核和黑质等处的神经元细胞核中有较强的表达,而在胞浆和突起内表达较弱。由此我们得出结论,Nogo和Nogo受体蛋白在成年小鼠脑内分布广泛。     

前体蛋白N端11肽对糖尿病小鼠脑海马神经元神经生长因子、神经元纤维蛋白及早老蛋白1表达的影响

目的 探讨前体蛋白N端11肽神经营养作用的机理。方法 用链脲佐菌素诱发小鼠糖尿病模型。小鼠分为：正常对照组（C组），糖尿病对照组（DM组），UPAN治疗组（UPAN DM组）。UPAN DM组于糖尿病造模后2周起至STZ给药后4周皮下注射UPAN，每次0.20μg，1次/d，造模成功4周后，将动物处死，行灌注固定取脑组织作冰冻切片，进行神经生长因子（NGF），神经元纤维蛋白（NF）及早老蛋白-1（PS-1）免疫组化染色。结果 UPAN可恢复或部分恢复糖尿病小鼠脑海马神经元NGF、NF及PS-1中的141（N端258-277）表达。结论 UPAN对糖尿病小鼠的神经元退行性变可能有改善作用，PS-1N端和C端增加的意义尚需进一步研究。     

复方金思维对阿尔茨海默病大鼠脑组织突触后致密区蛋白95表达的影响：与安慰剂及盐酸多奈哌齐干预效果的比较

目的：脑突触后致密区蛋白95具有调节人脑认知活动中突触功能和结构的作用，观察复方金思维干预实验动物致密区蛋白95表达以及学习记忆能力的变化，并与安慰剂及盐酸多奈哌齐干预相对照。方法：实验于2004-11-15／2005-02在北京中医药大学东直门医院药理实验室及首都医科大学宣武医院神经生化室进行。取雄性SD大鼠32只，随机分为4组，每组8只：生理盐水组、模型组、盐酸多奈哌齐组和金思维组。生理盐水组大鼠海马注入2μL生理盐水，其他3组大鼠缓慢注入2μL淀粉样B蛋白1～42(5g／L)，复制阿尔茨海默病模型。造模后3d开始给药，盐酸多奈哌齐组按0．92mg／kg的剂量灌胃；复方金思维(由中药人参、肉苁蓉、石菖蒲及郁金等组成)配置成0．36g／mL的浓度，按0．7μL／g的剂量给药；模型组及生理盐水组给3mL的双蒸水，均1次／d，共4周。4周后，以Morris水迷宫测试大鼠学习期间的逃避潜伏期和游泳距离以及记忆测定中的记忆能力，评价行为学变化；以免疫组化检测大鼠海马CA1区、皮质突触后致密区蛋白95表达的变化。结果：经补充后32只大鼠进入结果分析。①Morris水迷宫的学习、记忆测试结果：模型组大鼠逃避潜伏期、游泳距离及记忆能力显著低于生理盐水组(P&;lt;0．01)，盐酸多奈哌齐组、金思维组大鼠逃避潜伏期、游泳距离及记忆能力较模型组高(P&;lt;0．05)，盐酸多奈哌齐组和金思维组无差异(P&;gt;0．05)。②脑突触后致密区蛋白95表达：模型组大鼠海马和皮质的表达少于生理盐水组(P&;lt;0.01)；盐酸多奈哌齐组、金思维组大鼠海马、皮质的阳性表达高于模型组(P&;lt;0．05)，但盐酸多奈哌齐组与金思维组之间无明显差异(P&;gt;0．05)。结论：模型组大鼠脑突触后致密区蛋白95表达减少，说明脑突触功能弱化和受损，而金思维和盐酸多奈哌齐治疗组大鼠脑突触后致密区蛋白95表达较模型组增加，说明突触的功能及可塑性有所恢复。提示复方金思维对实验动物脑突触功能和结构具有改善作用。     

李氏5号中药对D-半乳糖老化小鼠海马超微结构及胰岛素受体底物表达的影响

目的:观察李氏5号中药对D-半乳糖老化小鼠海马超微结构和磷脂酰肌醇酯3激酶(phosphatidylinoditide-3'OHkinase,PI3K)、胰岛素受体底物-1(insulin-receptorsubstrate-1,IRS-1)、胰岛素受体底物-2(insulinreceptorsubstrate-2,IRS-2)表达的影响。方法:将132只小鼠随机分为6组,正常对照(C)组、D-半乳糖模型(D)组、李氏5号大剂量(L)组、中剂量(M)组、小剂量(S)组、多奈哌齐(A)组。D,L,M,S,A5组每日皮下注射半乳糖100mg/kg。L,M,S3个治疗组分别灌胃李氏5号方1.2,0.6,0.3g/(kg·d),A组多奈哌齐0.75mg/(kg·d)灌胃。4个月后,取小鼠海马CA1区组织进行电镜观察,行脑冷冻切片,用PI3K,IRS-1,IRS-2抗体进行免疫组化染色。结果:①电镜结构显示,D-半乳糖老化小鼠海马CA1区神经元核固缩,线粒体、高尔基体等细胞器肿胀,血管足突细胞肿胀,管腔变窄;李氏5号中药保护可以明显改善这种现象。②免疫组织化学染色结果显示3种抗体C组深染的阳性细胞在海马广泛分布,D组海马阳性反应细胞着色浅,少有突起,细胞数目少,分别为C组的48.8%,57.0%和60.8%。李氏5号方组染色结果与C组相似,A组亦有相同结果。结论:D-半乳糖老化小鼠海马CA1区出现明显超微结构病理改变,海马PI3K,IRS-1,IRS-2的表达明显下降;李氏5号中药保护能明显改善CA1区     

APP5肽类似物P165和罗格列酮对SH-SY5Y细胞IRS-1和p-CREB表达的影响

目的观察APP5肽类似物P165和罗格列酮(rosiglitazone)对链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)损伤人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞后,胰岛素信号通路相关因子IRS-1和p-CREB表达水平的影响。方法将人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞分为对照组、STZ损伤模型组(STZ 0.8 mmol/L)、罗格列酮保护组(STZ 0.8 mmol/L+罗格列酮20μmol/L),APP5肽类似物P165保护组(STZ 0.8 mmol/L+P165 30μmol/L),进行细胞形态观察,IRS-1和p-CREB免疫细胞荧光染色观察,采用image-pro plus图像分析软件测定平均吸光度值。结果与对照组相比,STZ损伤组细胞生长分裂减慢、突起缩短,细胞胞体皱缩,IRS-1和p-CREB免疫荧光染色强度减弱;与STZ损伤组相比,罗格列酮组和P165组突起伸展,细胞形态和细胞胞体皱缩现象明显改善,细胞出现强荧光染色。平均吸光度值测定结果显示:与对照组相比,STZ损伤组IRS-1和p-CREB平均吸光度值降低(P<0.008),与STZ损伤组相比,P165组和罗格列酮组平均吸光度值有所上升,差异均有统计学意义(P<0.008)。结论 APP5肽类似物P165和罗格列酮可能通过增加IRS-1、p-CREB的表达来改善STZ对于SH-SY5Y细胞的损伤,从而达到保护神经元的作用。     

不同能量的培养条件对人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞生长的影响

目的 建立热量限制的体外模型,观察不同能量培养条件下对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞生长代谢的影响.方法 将人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞分别采用含有低浓度(2 g/L)、正常浓度(3.15g/L)或高浓度(4.5 g/L)葡萄糖的培养基进行常规传代培养,利用MTT代谢率、细胞生长曲线及LDH漏出率等指标观察各组细胞生长情况.结果 与正常葡萄糖浓度培养条件下培养的对照组相比,高糖组细胞突起缩短,细胞胞体皱缩,MTT代谢率稍低(0.573±0.001),LDH漏出率高,细胞生长状态差;与对照组相比,低糖组细胞突起伸展,MTT代谢率较低(0.428±0.003),LDH漏出率低,细胞生长速度缓慢,但是形态良好.结论 高糖培养对细胞有损伤作用,细胞代谢加速,更容易衰老死亡;而低糖培养起到保护作用,在热量限制允许范围内降低培养液的含糖量,不但不会对细胞造成损伤,反而对细胞的代谢及生长起到保护作用,延长细胞的总体寿命.     

李氏5号中药对D-半乳糖老化小鼠海马超微结构及胰岛素受体底物表达的影响

目的：观察李氏5号中药对D-半乳糖老化小鼠海马超微结构和磷脂酰肌醇酯3激酶(phosphatidyl inoditide-3’OH kinase，PI3K)、胰岛素受体底物-1[insulin-receptor substrate-1，IRS-1)、胰岛素受体底物-2(insulin receptor substrate-2，IRS-2)表达的影响。方法：将132只小鼠随机分为6组，正常对照(C)组、D-半乳糖模型(D)组、李氏5号大剂量(L)组、中剂量(M)组、小剂量(S)组、多奈哌齐(A)组。D，L，M，S，A5组每日皮下注射半乳糖100mg／kg.L，M，S3个治疗组分别灌胃李氏5号方1．2，0．6，0．3g／(kg&;#183;d)，A组多奈哌齐0．75mg／(kg&;#183;d)灌胃。4个月后，取小鼠海马CAl区组织进行电镜观察，行脑冷冻切片，用PI3K，IRS-1，IRS-2抗体进行免疫组化染色。结果：①电镜结构显示，D-半乳糖老化小鼠海马CA1区神经元核固缩，线粒体、高尔基体等细胞器肿胀，血管足突细胞肿胀，管腔变窄；李氏5号中药保护可以明显改善这种现象。②免疫组织化学染色结果显示3种抗体C组深染的阳性细胞在海马广泛分布，D组海马阳性反应细胞着色浅，少有突起，细胞数目少，分别为C组的48．8％，57．0％和60．8％。李氏5号方组染色结果与C组相似，A组亦有相同结果。结论：D-半乳糖老化小鼠海马CA1区出现明显超微结构病理改变，海马PI3K，IRS-1，IRS-2的表达明显下降；李氏5号中药保护能明显改善CA1区超微结构病理改变，上调以上3项指标的表达。     

APP17肽对Aβ25—35诱导神经细胞凋亡保护作用

目的：通过形态学和生化学指标观察APP17肽对Aβ25－35诱发SH－SY5Y细胞凋亡是否有保护作用。并对其保护作用机制作进一步的探讨。方法：选用细胞形态观察，半定量LM－PCR DNA ladder Assay和流式细胞仪定量测定细胞凋亡率的方法观察APP17肽是否对Aβ25－35诱发SH－SY5Y细胞凋亡有保护作用；通过测定细胞MTT代谢率，共聚焦显微镜观察Aβ25－35和APP17肽对细胞内过氧化物含量，线粒体膜电位的影响以及Western Blotting观察细胞内凋亡诱导因子AIF及核转录因子NF－κB的表达情况，探讨了APP17肽的保护作用机制。结果：APP17肽可以明显改善Aβ25－35造成的细胞形态损伤，显著降低细胞凋亡比率；与Aβ25－35损伤组相比，APP17肽预孵育能明显提高细胞MTT代谢率，稳定线粒体膜电位，减少AIF的表达；有效降低Aβ25－35引起的细胞内过氧化物含量增高；并且使具有神经保护作用的核转录因子NF－κB表达增加。结论：APP17肽可以稳定线粒体功能，降低细胞内过氧化物含量，激活NF－κB并使其持续表达，对Aβ25－35诱导的SH－SY5Y细胞亡有比较明显的保护作用。     

APP17肽和救脑益智胶囊水提液对D-半乳糖脑老化小鼠海马PP-1表达的影响

为探讨 APP17肽及救脑益智胶囊水提液对 D-半乳糖脑老化小鼠海马蛋白磷酸酯酶 -1( PP-1)表达的影响。本研究将昆明小鼠随机分为 5组 :正常对照组、D-半乳糖对照组、APP17肽治疗组、小剂量中药治疗组、大剂量中药治疗组 ,每组动物 8只。用 D-半乳糖制备脑老化模型 ,并皮下注射 APP17肽或救脑益智胶囊水提液灌胃对 D-半乳糖脑老化小鼠进行治疗 ,3个月后取脑组织做 PP-1免疫组织化学染色。结果显示 :D-半乳糖小鼠和大剂量救脑益智胶囊水提液治疗组小鼠海马 PP-1阳性细胞数目少 ,染色淡 ;而正常小鼠、APP17肽保护和救脑益智胶囊水提液小剂量治疗的 D-半乳糖小鼠海马阳性反应神经元数目多 ,胞浆与突起深染。结果提示 :抑制凋亡的 PP-1在 D-半乳糖小鼠海马表达降低。 APP17肽和小剂量救脑益智胶囊水提液治疗能影响 D-半乳糖脑病小鼠脑内 PP-1的表达 ,使之接近正常。而大剂量救脑益智胶囊水提液治疗无此作用