多联袋无菌制备脐带血间质干细胞的方法及效果

目的:分析人脐带血间质干细胞分离培养方法及临床应用的安全性。方法:实验于2005-04/12在河南省红十字血液中心和郑州市第二人民医院完成。实验方法:①无菌条件下将脐带血液采集到无菌采血袋内,产妇及其家属均知情同意,并经医院伦理委员会批准。随机抽查62份样本,单份采集量80～160mL,计数有核细胞。②以1:1体积比将Ficoll-Hypaque混合溶液加入四联袋主袋内,将四联袋与脐带血收集袋相连,再将样本血液沿袋壁缓慢加入四联袋主袋内的液面上。离心后将四联袋主袋放在分浆夹上,袋内液体自上而下分为血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、多核细胞层、红细胞层5层。将血浆血小板层上2/3液体挤压入四联袋一空袋内,将剩余的血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层上部挤压入四联袋另一空袋内,即为富含有核细胞液体。③随机选择本院2005-04/12收治脑卒中后遗症患者10例。男9例,女1例,35～75岁,病程3个月～7年。诊断均由CT、MRI检查证实,符合第四届全国脑血管病学术会议修订的脑卒中诊断标准,患者均对治疗方案知情同意。将脐带血间充质干细胞经静脉输注入患者体内,每次输注1份,每例患者平均输注6份,每份间隔时间平均4d。于治疗前和治疗3个月后评价患者神经功能状态、肢体运动功能及日常生活活动能力。采用脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准评估神经功能,分数越低,神经功能状态越好;采用Fugl-Meyer评估患侧肢体运动功能,分数越高,肢体运动功能越好;采用Barthel指数评估日常生活活动能力,分数越高,日常生活活动能力越高。结果:①分离的62份脐血间质干细胞,每份含有有核细胞(3.62±2.39)×109,红细胞残余量为(1.64±1.25)×109,CD34 细胞的比率为(2.31±0.93)%,CD133 的比率为(1.36±1.23)%。培养7d后贴壁细胞为(3.27±1.85)×107,CD133 比率为(8.21±2.46)%。②患者治疗前与治疗3个月后相比,神经功能状态、肢体运动功能及日常生活活动能力评分均明显升高(治疗前:25.40±6.09,31.90±21.85,36.20±19.41;治疗后:1.90±5.09,80.9±25.00,81.10±15.93,P<0.01)。未发现免疫排斥及不良反应。结论:①利用多联袋无菌制备脐血间质干细胞分离效果良好,分离过程在密闭系统进行,单个核细胞和间质干细胞能满足临床需要,适合患者静脉输注和局部直接应用,方法简便安全可靠。②经静脉输注后,疗效确切,能明显改善脑卒中后遗症作用。     

犬原位回肠构建全尿道、膀胱的实验方法特征

目的:探索犬膀胱全切后以回肠构建全尿道、膀胱术的实验方法。方法:实验于2004-12/2005-07在吉林大学药学院生物工程研究室完成。体质量13kg的雄性京犬12只,术前禁食24h,以30g/L戊巴比妥钠按1mL/kg剂量对犬麻醉。取腹部正中切口,切除膀胱及尿道。在距回盲部约10cm处取一段30cm带血供的回肠袢,恢复肠道的连续性。取25cm回肠沿着肠管系膜的对侧缘纵向剖开,将剖开的肠管对折缝合成袋状,并将两侧输尿管种植于回肠新膀胱的适当位置。取5cm回肠剥离黏膜层并缝制成管状,构建尿道,在回肠新膀胱的底部戳孔与其缝合。连接在膀胱及尿道的原位,术中静点氧氟沙星100mL(含氧氟沙星0.2g/L)、葡萄糖注射液250mL、生理盐水250mL、缝合术后刀口,并静点氧氟沙星0.2g/d,连续给药7d,1周后正常进食、继续饲养1个月,观察动物排尿情况,行X射线影像学检查。结果:9只犬进入结果分析,另3只由于麻醉过度死亡。术后1个月观察实验动物犬,进食正常,排尿正常。术后4周X射线造影检查显示:贮尿囊显影良好,无梗阻;回肠替代膀胱充盈,肠黏膜替代尿道再生状况良好。结论:建立的犬膀胱全切原位回肠代膀胱、尿道术的实验方法,可做为组织工程膀胱、尿道移植研究的模型。     

脑微血管内皮细胞对体外缺氧神经干细胞增殖及凋亡的影响

目的:观察脑微血管内皮细胞对体外培养缺氧神经干细胞增殖、凋亡的影响。方法:实验于1996-01/1996-12在佳木斯大学神经科学所完成。实验材料:同一基因背景新生的Wistar大鼠由哈尔滨医科大学实验动物学部提供(黑动字第99102001)。实验方法:①取新生24hWistar大鼠大脑培养神经干细胞,采用免疫组织化学方法鉴定神经干细胞。②取出生1～7dWistar大鼠大脑培养脑微血管内皮细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定。③将培养传代纯化的脑微血管内皮细胞,用0.25%胰酶消化成单细胞液后接种于涂有多聚赖氨酸包被的盖玻片上,接种传3代后用胰酶消化的神经干细胞,以1∶10接种比例加入神经细胞完全培养液共培养。④用无菌石蜡油覆盖于低糖细胞培养液表面,制备低氧低糖溶液。对照组:正常神经干细胞置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养。缺氧共培养组:取共培养3d细胞,吸出培养液,用无菌Hank’s缓冲液清洗2次,加入低氧低糖溶液共同作用2,4,8,16h后换液,用PBS缓冲液冲洗3次后,换神经细胞完全培养液,置于细胞培养箱中复氧培养。缺氧单纯神经干细胞组:取传3代神经干细胞,用无菌Hank’s缓冲液清洗2次后,方法同上。实验评估:免疫组织荧光鉴定缺氧条件下神经干细胞的增殖与凋亡。结果:①免疫组织化学方法检测Nestin及Ⅷ因子相关抗原分别鉴定为神经干细胞及脑微血管内皮细胞。②对照组细胞胞体饱满,折光性强,周围有光晕。缺氧单纯神经干细胞组细胞胞体肿胀,折光性差,有大量细胞碎屑,仅有少量活细胞,并出现悬浮死细胞。缺氧共培养组细胞形态有所改善,细胞折光性仍较好,大部分细胞突起仍未见回缩,仅少数细胞肿胀,坏死。③随着缺氧时间的延长,细胞死亡明显增多,存活数明显下降。缺氧共培养组细胞存活数明显高于缺氧单纯神经干细胞组与对照组(321.76±22.20,180.00±17.89,255.33±10.33,P<0.01)。④缺氧条件下脑微血管内皮细胞对神经干细胞增殖及凋亡的影响:缺氧共培养组细胞存活数明显高于缺氧单纯神经干细胞组,细胞凋亡细胞数低于缺氧单纯神经干细胞组(P<0.05)。结论:脑微血管内皮细胞可以促进缺氧神经干细胞的增殖、减少其凋亡。     

组织工程韧带应用于前交叉韧带重建术的研究与进展

目的:总结和分析组织工程韧带代替自体和/或异体韧带(肌腱)重建前交叉韧带的实验研究进展。资料来源:应用计算机检索PubMed 1985-01/2005-12关于组织工程韧带重建前交叉韧带的文章,检索词“tissueengineering,anterior cruciate ligament”并限定文章的语种类为English。资料选择:对资料进行初审,纳入标准:组织工程韧带代替自体和/或异体韧带(肌腱)重建前交叉韧带研究的相关资料。排除标准:重复性研究。资料提炼:共收集到符合标准的文献30篇。资料综合:韧带的组织工程需要结构支架提供细胞生长的环境和基质;具有分化潜力的干细胞分布于支架,在生物和机械调制因子的作用下,增殖分化塑形为支架样,最后替代支架;组织工程特性生物材料在生长因子、细胞因子和营养成分的促进和生物力学因子的刺激下,干细胞能根据支架的性质改变细胞外的环境。结论:组织工程韧带重建前交叉韧带处于研究探索阶段,尚未进入到临床阶段。未来研究的目标是确证理想的培养媒体、机械刺激的力度、细胞种群和数量的选择,以及诱导组织工程韧带血管化的新技术。     

调配骨水泥经皮椎体成形术注入治疗老年骨质疏松性椎体压缩骨折的疗效及其生物相容性

目的：总结经皮椎体成形术治疗老年骨质疏松性椎体压缩骨折的临床效果,并观察骨水泥材料与宿主的生物相容性反应. 方法：①患者对象：阳江市中医医院2003-02/2005-12收治的骨质疏松症性椎体压缩性骨折患者26例（32个椎体）,在C形臂X射线机透视下,行经皮椎弓根途径椎体成形术治疗.其中65岁以下的8例患者（8椎体）在硬膜外麻醉下行体位及手法复位后再行经皮椎体成形术治疗.②骨水泥注入方法及途径：调配骨水泥为英国CORIN公司生产的低黏滞度聚甲基丙烯酸甲酯,在骨水泥中加入尹索显或欧乃派克,粉∶液∶造影剂比例为3∶2∶1.应用1 mL专用注射器（美国COOK公司产品）经穿刺针将处于黏稠阶段的骨水泥注入椎体,当骨水泥达椎体后壁即停止注射.如果单侧穿刺骨水泥分布未超过椎体中线,则同时行另一侧椎弓根穿刺.③效果评估：观察椎体高度的恢复,采用目测类比评分法评估疼痛缓解程度,并发症发生情况与材料及宿主的反应. 结果：26例均完成手术进入结果分析.①每椎体注射骨水泥3.5～8.0 mL,平均4.5 mL,24 h后即离床活动.②手法复位后行经皮椎体成形术者,椎体高度椎体高度恢复到正常的75%～90%,随访≥12个月无椎体高度丢失.③术前目测类比评分为8.1（5.6～9.5）分,术后为2.7（1.2～4.8）分.23例患者腰痛术后24 h内消失,3例陈旧性骨折患者腰痛术后部分缓解.④并发骨水泥椎旁渗漏4例4椎体,未发现特殊的材料和宿主反应;前引流静脉渗漏2例2椎体,无临床症状;穿剌针抽出脑脊液1例,改行另侧穿刺成功. 结论：①经皮椎体成术治疗老年骨质疏松性椎体压缩骨折具有微创、见效快、疗效肯定的优点.②体位及手法复位后行经皮椎体成术,能大部分恢复椎体高度,适合于年龄相对较轻,椎体楔形压缩较多的患者.③只要操作熟练,单侧椎弓根穿刺即能达到临床目的.④骨水泥材料与宿主之间呈现较好的生物相容性.     

电刺激小脑顶核联合神经干细胞共移植体治疗大鼠局灶性脑缺血

目的:观察局灶性脑缺血大鼠植入神经干细胞共移植体联合电刺激小脑顶核对新生血管密度的影响。方法:实验于2005-08/2006-11在佳木斯大学神经科学研究所完成。①实验分组:选取同一基因背景大鼠96只,随机数字表法分成4组:神经干细胞组、电刺激 神经干细胞组、神经干细胞共移植体组、电刺激 神经干细胞共移植体组,24只/组,移植后3,7,14,60d每个时间点各6只;另取新生24h内Wistar鼠1只用于神经干细胞的培养。共移植体由神经干细胞、层粘连蛋白和血管内皮细胞构成,由本实验室提供并鉴定。②实验方法:各组大鼠均采用线栓法建立大脑中动脉缺血模型,其中电刺激 神经干细胞组、电刺激 神经干细胞共移植体组于造模前1d行小脑顶核电刺激。以前囟为零点、正中线向后11.6mm、正中线向右1.2mm钻开颅骨后,用电针刺入脑内深5.6mm,给予直角方波脉冲刺激,电流强度为50μA,频率为0～100Hz,时程为0.5ms,连续刺激1h。各组均在造模后3d进行移植,移植部位为右侧纹状体缺血半暗带区。移植前分别将培养的神经细胞、神经细胞共移植体溶解于磷酸盐缓冲液中,细胞浓度调整为2×1010L-1。单纯神经干细胞组、电刺激 神经干细胞组植入神经干细胞悬液10μL,神经干细胞共移植体组、电刺激 神经干细胞共移植体组植入神经干细胞共移植体悬液10μL。③实验评估:各组分别于移植后3,7,14,60d腹腔麻醉取脑,制作石蜡切片,免疫组织化学法检测新生血管生成情况。结果:①新生血管免疫组织化学检测结果:新生血管是由单层扁平上皮细胞构成的,经免疫组化DAB显色后,新生血管内皮细胞的胞浆呈棕黄色,存在基底膜完整、不完整或无基底膜3种情况。②各种干预因素在不同时间点对新生血管生成的影响:各组在移植后3d均有新生血管生成,7d生成数量达到高峰,14d生成数量开始减少,至60d有较少的新生血管生成。以上各时间点电刺激 神经干细胞共移植体组新生血管密度均显著高于另外3组(F=7.12～15.86,P均<0.05)。结论:电刺激小脑顶核与神经干细胞共移植体移植能够促进大鼠局灶性脑缺血区新生血管的生成。     

细胞因子治疗特发性肺纤维化

目的:总结并分析细胞因子在特发性肺纤维化发病机制与治疗中的作用,特别是致炎细胞因子在特发性肺纤维化治疗中的应用。资料来源:应用计算机检索Pubmed1996-01/2006-05有关细胞因子治疗特发性肺纤维化应用及研究的文献,检索词“idiopathic pulmonary fibrosis,cytokines,biologic agent therapy,gene therapy”,并限定文献语言种类为English。资料选择:对资料进行整理,并查看每篇文献后的引文,选取针对性强的文章,同一领域的文献则选择近期发表或权威杂志的文章。纳入标准:关于特发性肺纤维化的概念、分类、发病机制和治疗方法及细胞因子在特发性肺纤维化发病机制和治疗方法中的作用。排除标准:重复性研究。资料提炼:共检索到54篇符合要求的相关文献,其中研究内容相似的,以近3年内发表的文章优先。对符合标准的30篇文献进行分析。纳入的文章主要涉及细胞因子在特发性肺纤维化的发病机制和治疗方法中的作用。资料综合:目前,特发性肺纤维化的传统药物疗法仍然存在争议。随着对特发性肺纤维化发病机制认识的逐渐深入,各种新的治疗策略相继出现。而最近的临床和动物试验研究均提出针对调节促纤维化细胞因子的治疗是比较有前途的治疗策略。促纤维化细胞因子的释放导致纤维细胞增殖并迁移到肺组织的不同部位,接着分化为不同的成纤维细胞亚型,而这种纤维细胞的分化可能是特发性肺纤维化慢性进程的关键原因。针对细胞因子治疗包括生物制剂治疗和基因治疗两大领域已经成为特发性肺纤维化治疗研究的热点和主要方向。本文从细胞因子在特发性肺纤维化治疗中的应用方面进行综述。结论:细胞因子在特发性肺纤维化发病中起到了促纤维化的关键性作用,针对细胞因子包括生物制剂治疗和基因治疗两大领域已经成为治疗特发性肺纤维化最有前景的手段之一。     

Proceedings of the Inaugural Strategy Meeting for the Establishment of a Southeast Asia Regional Therapeutic Plasma Exchange Consortium for Neurological Disorders

In conjunction with the third regional Southeast Asian (SEA) therapeutic plasma exchange (TPE) conference in Kuala Lumpur, Malaysia, 25 clinicians and researchers from SEA and South Asian countries attended the inaugural strategy meeting for the establishment of a regional TPE consortium for neurological disorders. The primary objective was to establish regional collaboration to improve delivery of TPE services in SEA. A pre‐meeting survey was conducted to gather insights on disease spectrum, contextual practice challenges, and the need for a regional TPE consensus. Challenges identified include limited healthcare funding in support of diagnostic workup, TPE therapy, as well as development of clinical infrastructure and expertise capacity building. There was favorable interest in developing a working plan contextualized to this region. Strategies to overcome challenges were discussed. This included the need for a comprehensive referral system and network of regional TPE centers suited to local needs, supported by innovative TPE delivery programs.     

重访GIK——谈极化液心脏保护与胰岛素强化治疗

自上世纪20年代发现胰岛素以来,胰岛素一直被用作糖尿病血糖控制的基本临床用药。最近的研究发现,胰岛素信号参与正常心血管功能的维系,而胰岛素信号的缺失（如胰岛素抵抗）可导致心血管功能障碍并参与心血管疾病的发生和发展。本课题组近期结合自身长期研究工作成果,在系统回顾相关重要文献的基础上,就胰岛索心肌保护机制及极化液（glucose-insulin-potassium solution,GIK）临床应用问题撰写综述,发表于欧洲心脏学会会刊《心血管研究》（Cardiovasc Res）。该综述全面阐释了胰岛素激活心血管内源性蛋白激酶B-内皮型一氧化氮合酶（Akl-eNOS）系统．进而通过“终效应分子”一氧化氮发挥心血管保护作用的机制．以及这一信号机制住心血管健康及缺血性心脏病等心血管疾病中的件用,重点强渊胰岛素生存信号障碍在胰岛素抵抗及诱发心血管疾病中的关键作用。     

Characterization of the biological activity of a potent small molecule Hec1 inhibitor TAI-1

Background

Hec1 (NDC80) is an integral part of the kinetochore and is overexpressed in a variety of human cancers, making it an attractive molecular target for the design of novel anticancer therapeutics. A highly potent first-in-class compound targeting Hec1, TAI-1, was identified and is characterized in this study to determine its potential as an anticancer agent for clinical utility.

Methods

The in vitro potency, cancer cell specificity, synergy activity, and markers for response of TAI-1 were evaluated with cell lines. Mechanism of action was confirmed with western blotting and immunofluorescent staining. The in vivo potency of TAI-1 was evaluated in three xenograft models in mice. Preliminary toxicity was evaluated in mice. Specificity to the target was tested with a kinase panel. Cardiac safety was evaluated with hERG assay. Clinical correlation was performed with human gene database.

Results

TAI-1 showed strong potency across a broad spectrum of tumor cells. TAI-1 disrupted Hec1-Nek2 protein interaction, led to Nek2 degradation, induced significant chromosomal misalignment in metaphase, and induced apoptotic cell death. TAI-1 was effective orally in in vivo animal models of triple negative breast cancer, colon cancer and liver cancer. Preliminary toxicity shows no effect on the body weights, organ weights, and blood indices at efficacious doses. TAI-1 shows high specificity to cancer cells and to target and had no effect on the cardiac channel hERG. TAI-1 is synergistic with doxorubicin, topotecan and paclitaxel in leukemia, breast and liver cancer cells. Sensitivity to TAI-1 was associated with the status of RB and P53 gene. Knockdown of RB and P53 in cancer cells increased sensitivity to TAI-1. Hec1-overexpressing molecular subtypes of human lung cancer were identified.

Conclusions

The excellent potency, safety and synergistic profiles of this potent first-in-class Hec1-targeted small molecule TAI-1 show its potential for clinically utility in anti-cancer treatment regimens.