靶向人PDE5A3基因的shRNA对人阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP的影响

目的:观察腺病毒载体介导特异性短发夹RNA(shRNA)对人阴茎海绵体平滑肌细胞环磷酸鸟苷(cGMP)的影响,为应用RNA干扰(RNAi)技术治疗阴茎勃起功能障碍(ED)提供实验依据。方法:成功构建携带3条针对人PDE5A3基因位点特异性shRNA的重组腺病毒(rAd5-shRNA-PDE5A3),并设立阴性对照病毒组和空白对照组,分别转染人阴茎海绵体平滑肌细胞。以放射免疫法分别检测转染重组腺病毒24、48、72h后细胞内cGMP浓度变化,观察rAd5-shRNA-PDE5A3对海绵体平滑肌细胞内cGMP的影响。结果:实验组rAd5-shRNA-PDE5A3转染人阴茎海绵体平滑肌细胞后胞内cGMP水平显著高于阴性对照组和空白对照组,在转染后72h最为显著。结论:3条特异性针对人PDE5A3mRNA靶位点的shRNA可有效地增加海绵体平滑肌细胞内cGMP的水平,增强对PDE5基因的阻抑效果。     

腺病毒载体介导PDE5-shRNAs对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞游离钙的影响

目的:观察腺病毒载体介导的PDE5-shRNAs对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞游离钙的影响,探讨利用RNAi技术治疗勃起功能障碍(ED)的可行性。方法:利用构建的携带2条靶向PDE5 mRNA靶位点的shRNAs重组腺病毒转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,同时设立阴性对照组和空白对照组,于转染后24、48、72 h用钙离子荧光探针Fluo-3/AM进行染色,然后在激光扫描共聚焦显微镜下动态检测细胞内钙离子荧光强度,以平均荧光指数(FI)反映细胞内游离钙的相对水平。结果:实验组在转染PDE5-shRNAs重组腺病毒24、48、72 h后钙离子荧光指数分别为829.3±7.8、801.5±9.5、856.3±8.7,均明显低于阴性对照组的1106.3±10.8、1121.3±10.2、1058.5±12.1和空白对照组的1076.6±9.7、1133.4±11.2、1104.3±10.5,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:腺病毒介导的靶向PDE5基因的shRNAs能够明显降低大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞内游离钙水平。     

成纤维细胞生长因子23在继发性甲状旁腺功能亢进症中的作用

目的 研究成纤维细胞生长因子23（FGF23）在继发性甲状旁腺功能亢进症（SHPT）中的作用。 方法 （1）收集38例维持性血液透析（MHD）患者血清,用ELISA法检测FGF23和化学发光酶免疫分析法检测全段甲状旁腺激素（iPTH）。（2）6例行甲状旁腺全切除（PTX）加自体前臂移植术的SHPT患者,取其甲状旁腺组织行细胞培养。培养24 h后用0.1 mg/L的FGF23分别刺激0、6、12、24、48 h时收集上清液检测iPTH。（3）取33例严重SHPT患者和3例健康人的甲状旁腺组织,用免疫组化SP法检测成纤维细胞生长因子受体（FGFR）1、FGFR3、转录因子GATA-3、增殖细胞核抗原（PCNA）及PV法检测Klotho的表达,计算阳性细胞率或积分吸光度。 结果 (1)MHD患者血清FGF23[（3901.85±2618.11） ng/L]与iPTH[（460.00±489.77） ng/L]呈正相关（r2 = 0.3009,P = 0.0004）。(2)FGF23仅在刺激24 h时,才有抑制iPTH的作用（P ＜ 0.05）,其它时段均无抑制作用。(3)SHPT患者甲状旁腺PCNA、 GATA-3、 FGFR3、 Klotho表达均显著高于健康人,而FGFR1表达显著低于健康人。(4)GATA-3阳性细胞率与血清iPTH水平及PCNA阳性细胞率均呈正相关（r2 = 0.1901,P = 0.0425;r2 = 0.2584,P = 0.0025）。Klotho表达与FGFR1和FGFR3表达呈正相关（r2 = 0.2046,P = 0.0082;r2 = 0.2833,P = 0.0014）。PCNA表达与FGFR1表达呈负相关（r2 = 0.1292,P = 0.0399);与FGFR3表达呈正相关（r2 = 0.1226,P = 0.0457）。FGFR1表达和血清磷水平呈负相关（r2 = 0.2329,P =0.0044）;与血清钙水平呈正相关（r2 = 0.1422,P = 0.0305）。 结论 MHD患者iPTH水平与FGF23水平呈正相关。FGF23能抑制iPTH分泌,但作用弱且短。这可能与GATA-3、甲状旁腺细胞增殖、FGFR3表达增多,FGRF1表达下降有关。     

医用臭氧对大鼠体外星形胶质细胞的毒性

目的 评价医用臭氧对大鼠体外星形胶质细胞的毒性.方法 Wistar大鼠12只,日龄1～2 d,麻醉下取脑,分离、培养星形胶质细胞,接种入24孔培养板,每孔1 ml,细胞浓度7 × 105/ml,分为4组(n=7):正常对照组(C组)加入无任何干预的完全培养基400 μl;不同浓度医用臭氧组(O2-O340组、O2-O360组、O2-O380组)分别加入经40、60、80 μg/ml医用臭氧干预的完全培养基400 μl,于孵育2 h(T1)、4 h(T2)时观察细胞形态,测定星形胶质细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及乳酸脱氢酶(LDH)漏出率.结果 O2-O360组与O2-O380组胞体肥大、肿胀、突起增多,胞浆内出现黑色变性颗粒及空泡样改变,核固缩细胞增多,O2-O380组更明显.与C组比较,T1时O2-O340组SOD活性和MDA含量升高,LDH漏出率降低,O2-O360组SOD活性和MDA含量升高,O2-O380组SOD活性和MDA含量升高,LDH漏出率升高,T2时O2-O340组SOD活性升高,MDA含量和LDH漏出率降低,O2-O360组SOD活性和LDH漏出率升高,O2-O380组MDA含量和LDH漏出率升高(P<0.01);O2-O340组、O2-O360组和O2-O380组T1时MDA含量和LDH漏出率依次升高,T2时SOD活性依次降低,MDA含量和LDH漏出率依次升高(P<0.01);与T1时比较,T2时O2-O340组、O2-O360组和O2-O380组SOD活性和MDA含量降低,O2-O360组和O2-O380组LDH漏出率升高(P<0.05).结论 医用臭氧对大鼠体外星形胶质细胞的毒性作用与其浓度和作用时间有关.     

异丙酚对内毒素诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Toll样受体4表达水平的影响

目的 探讨异丙酚对内毒素诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Toll样受体4(TLR4)表达水平的影响.方法 SPF级雄性Wistar大鼠,体重180～250 g,8～9周龄,原代培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞,经鉴定后随机分为5组,每组18孔,对照组(C组):不给予任何药物,继续培养3 h;LPS组:加入LPS,终浓度1μg/ml,孵育3 h;异丙酚组(P1～3组):同时加入LPS(终浓度1μg/nd)和终浓度分别为25、50、100 μmol/L的异丙酚,孵育3 h.孵育结束后测定肺泡Ⅱ型上皮细胞TLR4 mRNA、TLR4蛋白表达和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的释放量.结果 与C组比较,LPS组和P1组TLR4 mRNA及其蛋白表达上调(P<0.05),P2组和P3组差异无统计学意义(P>0.05);与LPS组比较,P2组和P3组TLB4 mRNA和其蛋白表达下调,TNF-α释放量降低(P<0.05或0.01),P,组上述指标差异无统计学意义(P>0.05);P2组与P3组上述指标差异无统计学意义(P>0.05).结论 异丙酚可抑制LPS诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞TLR4 mRNA及其蛋白表达上调,且呈浓度依赖性,这可能是其抑制肺局部炎性反应的机制.     

通过PD-1/PD-L1共刺激通路诱导小鼠胰岛移植免疫耐受的研究

目的 观察重组腺病毒Ad-PD-L1对诱导小鼠胰岛移植免疫耐受的作用.方法 酶切含有小鼠全长PD-L1 cDNA的pSport 1-mCD274质粒,亚克隆到穿梭质粒pShuale-GFP-CMV(-)上,再通过酶切、连接等方法构建腺病毒骨架质粒pAdxsi-GFP-CMV-PD-L1,转化DH5α感受态细菌,筛选阳性克隆.经酶切、测序鉴定正确,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增,氯化铯密度梯度离心纯化病毒.链脲霉素(250 mg/kg)腹腔注射诱导C57BL/6(H-2b)小鼠糖尿病模型,将C57BL/6小鼠随机分为3组,A为对照组,B为Ad-EGFP处理组,C为Ad-PD-L1处理组,在进行胰岛移植的前1天,经尾静脉输注5×108 pfu的Ad-PD-L1.将DBA/2(H-2d)小鼠的胰岛移植在糖尿病小鼠肾被膜下.术后监测不同时间各组小鼠的血糖变化及胰岛移植物的存活时间,并观察混合淋巴细胞反应的特异性.结果 酶切及测序证实Ad-PD-L1构建成功.Ad-PD-L1在小鼠体内可以高效地表达PD-L1,Ad-PD-L1治疗组胰岛移植物的存活时间明显延长到27.63±3.51 d(P<0.01),混合淋巴细胞反应表明小鼠对供体反应特异性降低. 结论通过PD-L1/PD-1共刺激通路可以抑制T细胞的活化,从而延长了胰岛移植物的存活时间.     

Hint1基因抑制HepG2细胞AP-1转录因子活性的实验研究

目的 探索体外过表达Hint1基因对人肝肿瘤HepG2细胞AP-1转录因子活性的影响.方法 分子克隆获得Hint1基因序列,构建pHA-Hint1重组融合基因表达载体.阳离子脂质体介导,pHA-Hint1转导人肝母细胞瘤HepG2细胞,RT-PCR和Western blot检测HepG2细胞中外源HA-Hint1表达.pHA-Hint1质粒、启动子荧光素酶报告质粒AP-1/Luc及巨细胞病毒-β-半乳糖酶报告质粒(β-gel)共转导HepG2细胞.36 h后测定荧光素酶活性及β-gel活性.结果 重组质粒经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,获约100 bp特异条带,测序证实成功构建pHA-Hint1表达载体.pHA-Hint1及空载体pcDNA3/HA转导HepG2细胞,半定量RT-PCR结果显示pHA-Hint1组Hint1mRNA表达高于空载体组(t=3.89,P<0.05);Western blot结果显示pHA-Hint1组HA标签蛋白表达高于空载体组(t=3.12,P<0.05).AP-1转录因子活性检测结果:pHA-Hint1终浓度为0 μg/ml,0.5 μg/ml,1.0 μg/ml,1.5 μg/ml,2.0 μg/ml时,AP-1转录因子相对活性(106)为:5.12±0025、4.24±0.74、3.43±0.31、2.62±0.48、2.09±0.21.随着pHA-Hint1浓度增加,荧光素酶活性呈明显下降,当pHA-Hint1浓度达到1.5 μg及2.0 μg时,差异有统计学意义(F=72.009,P<0.05).结论 过表达Hint1基因可抑制HepG2细胞AP-1转录因子活性.     

A-T形皮瓣修复头皮缺损

目的：介绍头皮缺损修复的一种方法。方法：先将缺损修剪成梯形或等腰锐角三角形创面。沿底边向两侧做切口线,长度分别为底边边长的1～2倍;切口线末端各做一个顶与创面方向相反,边长为1～1．5cm的等腰三角形,以利于皮瓣向创面移动。在帽状腱膜层与颅骨骨膜之间形成皮瓣,向受区推进修复创面。结果：14例头皮缺损中,面积最小为3cm×3cm,最大为6cmc4cm,全部皮瓣存活良好,创面得以Ⅰ期修复。结论：A-T形皮瓣制作简单,因该皮瓣的剥离范围广泛,对于皮肤缺乏弹性和活动性的头部来讲,是修复该部位缺损的一种良好方法。     

岛状鼻侧软骨粘膜瓣的解剖学研究及临床应用

目的：研究进入鼻侧软骨区域的主要血管,为设计内眦血管蒂岛状鼻侧软骨粘膜瓣修复眼睑衬里和睑板缺损提供解剖学基础,并介绍其临床应用经历。方法：10具存放一年的成年尸体标本从颈总动脉灌注红色乳胶,在2具尸体标本的面静脉内注入蓝色乳胶溶液。在3．5倍的手术放大镜下进行解剖,显露鼻背和鼻周区的血管。结果：内眦动脉发出分支从鼻侧软骨的外上方开始斜向其内下方向走行进入鼻侧软骨的表面,并与鼻背动脉和鼻外侧动脉向鼻侧软骨表面发出的分支相互吻合。并且内眦静脉与其伴行。应用岛状鼻侧软骨粘膜瓣修复下睑缺损1例,效果满意。结论：以内眦血管为蒂的岛状鼻侧软骨粘膜瓣具有良好的血液供应,血管蒂长并且走行比较恒定,可转移到眶区修复部分眼睑衬里和睑板缺损。     

复合组织下蒂法乳房缩小整形术25例

目的：回顾性总结复合组织下蒂法乳房缩小整形术25例病例资料,探讨复合组织下蒂法乳房缩小整形术手术注意事项及其并发症防治。方法：从2003～2008年5年间,对25例女性乳房肥大患者分别进行手术治疗,方法采用复合组织下蒂法。通过对术中复合组织下蒂的修整及术后乳房外形、乳头乳晕复合体血运、术后瘢痕及乳房感觉等方面观察,分析复合组织下蒂法乳房缩小整形术的术中注意事项及术后并发症的防治策略。结果：25例患者均取得了较好的效果,无乳头乳晕复合体血运障碍发生。结论：复合组织下蒂法乳房缩小整形术是较好的乳房缩小术式,良好的术前设计及术中调整是确保手术成功的关键。