Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-positive cells in cerebrospinal fluid and development of overt CNS leukemia: a 5-year follow-up study in 113 children with a TdT-positive leukemia or non- Hodgkin's lymphoma

We investigated whether an indirect nuclear terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) immunofluorescence (IF) assay on single cells present in the cerebrospinal fluid (CSF) is more effective than conventional cytomorphology for early detection or exclusion of (minimal) meningeal leukemic infiltration in patients with a TdT+ malignancy. During a 5- year follow-up study, 1,661 consecutive CSF samples from 113 children with a TdT+ acute lymphoblastic leukemia (ALL) (n = 100), a TdT+ acute nonlymphoblastic leukemia (ANLL) (n = 8), or a TdT+ non-Hodgkin's lymphoma (NHL) (n = 5) were analyzed. In 1,511 (91.9%) of 1,643 evaluable CSF samples, the positive and negative findings of both cytomorphology and the TdT-IF assay were concordant. In 47 (2.9%) samples from 28 patients, the cytomorphology was suspect while the TdT- IF assay was negative; follow-up as long as 58 months revealed no CNS leukemia in any patient. In 85 (5.2%) samples, cytomorphology was negative (n = 70) or suspect (n = 15) but TdT+ cells were detected. RBC contamination seriously hampered evaluation in 31 of these 85 samples. From the remaining 54 TdT+ samples from 29 patients, 40 samples preceded overt CNS leukemia in 20 patients. Two consecutive findings of TdT+ cells in the CSF were always followed by overt CNS leukemia. At initial diagnosis, 11 children had TdT+ cells in their RBC-free CSF. In one of these children, morphology was suspect; a repeated lumbar puncture was positive on both assays. Thus, initial CNS leukemia was diagnosed. In the other ten children, morphology was negative. In six of them, CNS leukemia was diagnosed 2 to 20 months later. In 32 other children examined at initial diagnosis, neither TdT+ cells nor blasts were observed in the CSF. In none of these patients was a CNS leukemia diagnosed after a follow-up of 2.5 to 57 months (median 24 months). In 207 control CSF samples from 58 children with TdT- oncologic, hematologic, or infectious diseases, no TdT+ cells could be detected. The TdT-IF assay is easy to perform and is a more reliable diagnostic tool for detection of CNS leukemia at an early stage than is cytomorphology. At initial diagnosis, the finding of Tdt+ cells in a RBC-free CSF sample with a negative cytomorphology is highly predictive for development of overt CNS leukemia.     

Establishment and characterization of an Epstein-Barr virus transformed cell line with strong phagocytic activity

An immunoglobulin M (IgM)-positive cell line, Ms 28, apparently spontaneously transformed by Epstein-Barr virus (EBV) was established from peripheral blood cells of a patient with immature myeloblastic leukemia. It has been characterized according to phenotype, cytochemistry, and membrane antigen pattern. The cell line expresses lymphoid markers like CD 19, CD 22, and CD 30 and synthesizes and secretes IgM. Monocyte markers CD 11c, CD 14, and CD 15 are absent. Neither interleukin-1 (IL-1), nor tumor necrosis factor (TNF-alpha) are produced. But Ms 28 cells show strong phagocytic activity and engulf Latex particles and sheep RBCs (SRBCs) that need not to be opsonized. The phagocytic activity can be inhibited by chloroquine. Both phagocytosis and EBV nuclear-antigen (EBNA) expression can be observed in one and the same cell. Ms 28 cells might be useful to study immunologic activities like antigen processing and presentation.     

构建以少突胶质细胞前体为主与人类早产儿脑室周围白质软化病理相似的动物模型

目的:建立以晚期少突胶质细胞前体为主、与人类早产儿脑室周围白质软化病理相似的可靠动物模型。方法:实验于2005-10/2006-06在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心完成。2d龄和7d龄SD同窝清洁级新生大鼠各43只,雌雄不拘,以随机数字表法分为4组,即2d龄模型组(n=25)、2d龄假手术组(n=18)、7d龄模型组(n=25)和7d龄假手术组(n=18),脑室周围白质软化动物模型建立:结扎双侧颈总动脉,手术时间短于10～15min,术后将新生大鼠送入缺氧箱缺氧30min,混合气体为体积分数0.08的O2和0.92的N2,输入流量为1～2.5mL/min。假手术组游离双侧颈总动脉,但不予结扎和缺氧。将各组大鼠分别于术后1d测定脑梗死体积,术后2d进行少突胶质细胞系列免疫组织化学染色分析、脑片TTC染色观察脑梗死情况以及光镜下脑病理研究,术后21d进行电镜下病理研究。结果:实验86只新生大鼠,14只制作脑室周围白质软化模型死亡,余72只计入统计。①术后1d各组脑片大体观察:模型组脑内呈现大面积白色梗死区,多为大脑前、中动脉供血区域,2,7d龄模型组梗死体积分别为(53.45±33.90),(68.78±20.22)mm3,梗死百分比分别为(24.98±15.44)%,(11.84±4.14)%;假手术组脑片颜色鲜红,未见白色梗死区。②新生大鼠少突胶质细胞系列标志物免疫组织化学结果:2d龄新生大鼠脑白质内以少突胶质细胞前体为主,7d龄新生大鼠则以成熟少突胶质细胞为主。模型大鼠的相应少突胶质细胞系列阳性标记物的积分吸光度值均显著低于同日龄对照新生大鼠(P<0.05～0.01)。③各组大鼠术后2d光镜下脑病理检查结果:2d龄模型组新生大鼠的脑室周围以及皮层下白质呈现囊性坏死和细胞凋亡,而皮质神经元损伤轻微;而7d龄模型组在白质和皮质部位均呈明显损伤。④术后21d电镜下各组幼鼠脑病理检查结果:2d龄模型组幼鼠的脑白质内未见髓鞘形成,7d龄模型组幼鼠中见少量髓鞘形成,而同日龄假手术对照幼鼠的脑白质内则髓鞘形成正常。结论:通过对2d龄新生大鼠双侧颈总动脉结扎伴缺氧30min缺氧缺血法创建的脑室周围白质软化新生大鼠模型中存在少突胶质细胞前体和少突胶质细胞的明显受损和丢失,成功建立了2d龄新生大鼠以少突胶质细胞前体为主、与人类早产儿脑室周围白质软化病理相似的脑室周围白质软化动物模型。     

聚乙二醇在猪组织工程瓣膜制备中的应用

目的:观察聚乙二醇法在组织工程瓣膜准备中的应用价值,比较聚乙二醇去细胞前后组织工程瓣膜的物理特性。方法:实验于2005-10/2006-03在华中科技大学同济医学院基础医学院生物化学系实验室完成。①实验分组:取猪10只,由于猪主动脉瓣为三叶瓣结构,共取得瓣叶组织30个,麻醉后宰杀取其心脏动脉瓣膜,分为去细胞组和对照组,每组各15个。②实验方法:去细胞组用聚乙二醇和DNase I处理;瓣叶组织放入1kg/L聚乙二醇,室温下浸泡30～45min,振荡器加以振荡;含抗生素磷酸盐缓冲液浸泡24h,反复3次洗脱;以5×104U/L DNase I液浸泡处理1h;对照组仅以含抗生素磷酸盐缓冲液浸泡24h,反复3次洗脱。③实验评估:苏木精-伊红染色、扫描电镜观察去细胞情况,吸光度(A)值,计算去细胞率(%)=(对照组A值-去细胞组A值)/对照组A值×100%。猪去细胞瓣膜条置于力学测试仪测定最大负荷、最大应力、最大应变和弹性模量。结果:纳入猪10只,均进入结果分析。①去细胞组织形态学观察:去细胞组猪瓣膜组织中看不到细胞成分,且细胞外基质结构保存完整,胶原纤维排列整齐,无明显断裂,仍呈波浪状平行排列,结构紧凑,弹性纤维结构清晰,组织无明显水肿。②DNA含量分析:聚乙二醇处理后去细胞百分率为95.32%。③生物力学检测:与对照组比较,去细胞组瓣膜组织最大负荷[(12.586±1.693),(10.242±1.435)N,P>0.05]、最大应力[(2.346±0.342),(1.877±0.572)N/mm,P>0.05]、弹性模量(15.152±1.579,14.549±0.678,P>0.05)、最大应变[(31.685±7.533),(28.118±6.045)mm/N,>0.05]等均无显著差异。P结论:聚乙二醇法去除细胞完全,细胞外基质保存完整,对组织机械性能无明显影响,适于构建组织工程瓣膜。     

胶原性关节炎大鼠滑膜组织细胞因子基质金属蛋白酶3和组织金属蛋白酶抑制剂1表达的变化

目的:观察Ⅱ型胶原诱导的实验性关节炎动物模型组织细胞因子基质金属蛋白酶3和组织金属蛋白酶抑制剂1表达的变化,探讨基质金属蛋白酶3和组织金属蛋白酶抑制剂1在类风湿关节炎发病机制中的作用。方法:实验于2005-09/2006-11在白求恩国际和平医院中心实验室完成。①实验分组:健康雄性Wistar大鼠60只,体质量(100±20)g,随机选出50只以备造模,另外10只作为对照组。在造模成功的大鼠中再随机选出10只作为模型组。②实验方法:采用10mg牛Ⅱ型胶原与100mg弗氏不完全佐剂和60mg卡介苗充分研磨后,以每支每点0.1～0.2mL(1g/L)从大鼠背部尾根部多点皮下注射,于10d后按上述方法和剂量再次重复免疫和制作大鼠胶原性关节炎模型。③实验评估:初次免疫后7周,剥离膝关节滑膜,进行苏木精-伊红染色光镜下观察;切除另侧膝关节滑膜,免疫组织化学染色后,用Metamorph图像分析系统进行检测,计算每个视野基质金属蛋白酶3和组织金属蛋白酶抑制剂1的阳性面积比,以其作为阳性反应细胞密度。结果:纳入大鼠60只,20只进入结果分析。模型组大鼠关节组织中的基质金属蛋白酶3阳性密度为0.75±0.19,明显高于对照组,差异有显著性意义(P<0.01);组织金属蛋白酶抑制剂1的表达阳性密度为0.48±0.17,与对照组0.78±0.21比较明显降低,差异有显著性意义(P<0.01)。结论:细胞因子基质金属蛋白酶3和组织金属蛋白酶抑制剂1表达的变化与胶原性关节炎大鼠的发病相关。     

人脂肪干细胞复合脱细胞软骨基质支架在生物反应器中构建组织工程软骨

目的:观察人脂肪干细胞复合脱细胞软骨基质支架在生物反应器中初步构建组织工程软骨的可行性。方法:实验于2005-04/2006-05在解放军总医院骨科研究所完成。脂肪组织和关节软骨均来自膝关节置换术中切除的组织,并经患者知情同意。关节软骨冻干后经粉碎机粉碎,过筛,选取25～38μm大小的软骨微粒。在样品中先加入2.5g/L胰蛋白酶,37℃消化24h,再加入1%Triton X-100震荡72h。将软骨微粒和蒸馏水按1∶3的比例混合后滴加在模板中,置入冷冻干燥机冻干后行紫外线交联。紫外线照射8h完成。最后经25kGy 60Co辐照灭菌完成支架制备。取膝关节置换术中切除的髌下脂肪垫,酶消法获得脂肪干细胞,扩增后复合于脱细胞软骨基质制成圆柱状三维支架上(细胞密度5×1010L-1),置于生物反应器中进行诱导培养,同时设静态培养组作为对照,3周后观测大体形态和组织学形态变化,同时进行组织化学(包括番红花O,阿利新蓝染色)和Ⅱ型胶原免疫组织化学分析。结果:生物反应器组诱导培养3周苏木精-伊红染色显示支架结构消失,只有中心区域残存少量支架结构;静态培养组支架结构尚存在,有少量基质分泌。番红花O染色显示生物反应器组细胞外有大量蛋白聚糖沉积,阿利新蓝染色表明有软骨特异性蛋白多糖的聚集;而静态培养组只有部分区域染色且淡于生物反应器组。Ⅰ型胶原免疫组化的结果显示,在生物反应器组细胞能够合成大量软骨细胞特异性胶原成分,而静态培养组呈弱阳性。结论:生物反应器培养明显促进了脂肪干细胞的增殖与软骨分化,是体外构建组织工程软骨的良好方法。     

应用质谱、红外光谱及核磁共振解析验证合成物9,10-二羟基硬脂酸的纯化性

目的：为获得大量的9,10-二羟基硬脂酸（Dihydroxy Stearic Acid,DHSA）,应用质谱、红外光谱及核磁共振解析验证合成物为DHSA。 方法：实验于2007-01/05在解放军总医院营养科实验室完成。在烧瓶中加入油酸后,再加入甲酸、过氧化氢,并不断搅拌。在整个反应过程中维持反应温度在40℃,反应四五小时后,反复水洗油层并收集。在油层中加入3mol/L NaOH溶液25mL,于100℃水浴加热1h,趁热加入3mol/L HCl50mL,剧烈搅拌,析出白色沉淀。用水反复清洗使清洗液pH值为中性,收集沉淀物。在沉淀物中加入体积分数为0.95的乙醇10mL,加热溶解,抽滤,将滤液于0℃析出结晶,抽滤,将抽滤物用体积分数为0.95的乙醇10mL加热溶解,于0℃结晶,抽滤。同样方法再结晶2次,最后得到白色结晶物,晾干,收率68.8%。将结晶物分别上FTS-65A红外光谱仪、ISONS EA1108型元素分析仪,Varian INOVA 600型核磁共振仪,安捷伦XCR-trap液相质谱（LC-MS）联用仪进行分析和结构鉴定。 结果：①LC-MS分析提示合成的DHSA经过多次重结晶后,纯度较高,可达95%。MS分析提示DHSA相对分子质量为315.1,与理论值316.48相近。②DHSA元素分析实验值C68.78%,H11.53%,与理论值C68.77%,H11.58%接近。③红外光谱分析提示DHSA为含有两个羟基的十八碳长链脂肪酸。④核磁共振的氢谱和碳谱均证实合成的化合物为9,10-二羟基十八碳脂肪酸。 结论：合成的DHSA经过3次重结晶后,纯度可95%以上,质谱、红外光谱及核磁共振解析结果证实合成的化合物是9,10-二羟基硬脂酸。     

儿科患者围术期椎管阻滞的镇痛效应

目的:探讨儿童围术期镇痛的必要性及椎管阻滞应用的可行性。方法:以"pediatric patient,analgesia,perioperat"为检索词,检索1990-01/2004-12PubMed数据库关于儿童围术期镇痛的文献,选取随机对照研究设计的文献,对其中14篇进行归纳总结。结果:①疼痛的并发症:儿童围术期的疼痛不但与成人一样影响血流动力学稳定、增加术后并发症和死亡率;还可导致慢性疼痛综合征、注意力不集中、学习能力下降等并发症。②多模式镇痛:疼痛治疗可在形成疼痛的转化、传导、整合、认知4个水平采取措施。复合使用多种作用机制不同的药物可以减少每种药物的用量,减少副作用,取得更好的疗效。采用超前镇痛,在伤害性刺激之前施行疼痛治疗,只有当伤害性刺激完全被阻断时,超前镇痛的优势才能显现出来,而且阻断时效应该比术后急性疼痛时间长。③疼痛的评价:目前临床常用评分方法是NIPS(neonatalinjurypainscale)评分系统,包括面部表情、哭吵、呼吸形式、上下肢运动和觉醒状态5个指标。评分越低说明疼痛越轻。④围术期椎管阻滞镇痛治疗:重点介绍硬膜外技术、硬膜外常用药物及剂量、适应证、并发症等。结论:有必要对儿童施行围术期镇痛,椎管阻滞是儿童围术期镇痛一种切实可行的方法。     

应用遥测肌电技术实测分析人体助行带的生物力学作用

目的:人体助行带为一种随身佩带的动力装置,应用遥测肌电技术测定和分析自行研制的人体助行带的生物力学作用机制。方法:实验于2005-12/2006-06在天津体育大学运动生物力学实验室进行。选取天津市天津医院30名受试对象,均对本实验知情同意。按照生物力学的测试要求,首先对受试者进行5次以上行走状态下的遥测肌电测定,然后在同等条件下对受试者佩带助行带实施对照研究。实验采用的助行带为自行研制的,由腰至足以双层弹力带作为动力装置的弹性结构。结果:行走摆动相大腿肌肌电:佩带助行带后肌内侧肌、肌二头肌、半腱肌肌电高于佩带前(P<0.01)。支撑相小腿肌肌电:佩带助行带后胫前肌、腓骨长肌、腓肠肌肌电高于佩带前(P<0.01)。结论:通过弹力带施加于下肢的外部载荷,能够起到增强下肢肌电以及产生助行的生物力学功效。